哺乳动物基因LSL介导条件性表达质粒载体

概述

常规质粒基因表达载体系统利用LoxP-Stop-LoxP(LSL)表达盒,在哺乳动物细胞和动物体内实现Cre介导的条件性基因激活表达。LSL表达盒包含三个重复的SV40 polyA,序列两端为LoxP位点。用户选择的启动子位于LSL表达盒的上游,而用户感兴趣的基因位于其下游。在Cre重组酶不存在的情况下,该表达盒完全阻断了目的基因的正常表达;当将Cre引入携带该载体的细胞中时,目的基因上游的LSL表达盒将会被删除,从而目的基因能够在用户选择的启动子下被永久激活表达。

该载体不仅适用于体外细胞培养,更适用于转基因动物模型的构建。当携带这种载体的转基因动物与携带组织特异性表达Cre的转基因动物杂交时,产生的动物后代将在特定的细胞中组织特异性表达Cre,从而启动目的基因在该特定细胞中组织特异性表达。

在细胞培养中使用该载体系统时,可将抗生素或荧光标记添加到载体中,使转染后的细胞可被筛选或可示踪以便于分离出已永久整合载体的细胞。

关于该载体系统和Cre介导重组的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Mol Biotechnol. 16:151 (2000) Overview of vector design for mammalian gene expression
EMBO J. 12:2539 (1993) Transcription blocker prevent transcriptional interference
J Biol Chem. 259:1509-14 (1984) Purification and properties of the Cre recombinase protein
Genesis. 26:99-109. (2000) Review of the Cre/LoxP recombination system

亮点

该载体是为在哺乳动物细胞和动物体内实现Cre介导的条件性基因表达而设计的。目的基因的表达最初是沉默的,但通过与Cre重组酶的共表达后,目的基因上游的3x SV40 pA将会删除,从而目的基因能够在用户选择的启动子下被永久激活表达。

优势

基因的稳定激活:经过Cre重组酶处理后,阻断下游基因转录的3x SV40 pA将被永久删除,随后客户选择的启动子能够驱动的目的基因的正常表达。

技术简单:常规转染即可把质粒转入细胞,相比起病毒载体需要进行病毒包装,过程更简单。

载体容量非常大:我们的载体总容量可达30 kb,其中质粒骨架只占3 kb,有足够大的容量可以放置客户所感兴趣的序列。

高水平表达:常规质粒转染细胞后,可以产生非常高的拷贝数(每个细胞多达几千拷贝),使外源基因能高水平表达。

适用于体内应用:该载体不仅拥有良好的体外细胞转导能力,更适用于体内活体动物实验,如Cre介导的条件性基因表达转基因动物。

不足之处

载体DNA非整合型:常规质粒在细胞里主要以游离DNA状态存在,所以常规质粒转染也称为瞬时转染。然而,质粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因组中(质粒转染每102~106个细胞可能会有一个细胞的基因组被整合,整合效率取决于细胞类型)。如果将携带了药物抗性基因或者荧光标记基因的载体转到细胞中,在经过扩大和传代培养后,可以使用药物筛选或细胞分选来获得稳定整合了该载体的细胞。

可转染的细胞类型受限:不同类型细胞的质粒转染效率差异很大。非分裂细胞比分裂细胞更难转染,原代细胞比永生化细胞系更难转染。一些重要的细胞类型更是难以转染,如神经元和胰岛β细胞。另外,质粒转染局限于体外细胞实验,很少运用到活体实验。

基因拷贝数在不同细胞中呈现差异性:尽管成功的转染可以在单个细胞里产生非常高的拷贝数,但不同细胞间却有高度的差异性。在一些细胞中,质粒拷贝数非常高,而在另外一些细胞却是低拷贝甚至没有。而病毒转导更倾向于相对均匀地把基因转到细胞中。

载体关键元件

Promoter: The promoter that will drive expression of your gene of interest after treatment with Cre recombinase.

LoxP: Recombination site for Cre recombinase. When Cre is present the region flanked by the two LoxP sites will be excised.

3x SV40 pA: Three repeats of the simian virus 40 late polyadenylation signal. This terminates transcription from the upstream promoter, preventing expression of the downstream gene of interest.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.