mRNA体外转录载体

概述

我们的体外转录载体是简单有效的RNA转录系统,适用于各种研究。通过mRNA体外转录载体获得的mRNA适用于体外翻译、生物化学研究、注射入细胞或胚胎后的蛋白表达、以及特定序列的其他mRNA应用。

该系统利用目的序列上游的T7启动子,通过T7噬菌体RNA聚合酶(T7 RNAP)和三磷酸核苷酸,在适当的反应条件下高效生成mRNA。我们建议您参考已发表文献中经测试的体外转录步骤说明来进行体外转录。

T7 RNAP对于有效的转录起始具有碱基要求,且这些碱基已经被放置到载体上。T7启动子3'末端的前两个碱基是GG,紧接着是客户的目的序列。

我们的mRNA体外转录载体会发生失控转录,这意味着T7 RNAP的转录能进行到DNA模板的末端,不会在质粒内的任何特定位点终止。因此,在体外转录之前,应通过使用SapI,BsiWI或AscI等限制性内切酶来单酶切线性化环状质粒,以确保转录物的长度和序列,这些单酶切位点紧邻poly(A)序列的下游。值得注意的是,待转录的序列不能含有所用线性化酶切位点,以免产生截短的mRNA。不纯的酶切产物可能会抑制随后的转录反应,因此建议通过柱子或酚氯仿来纯化酶切产物。

在体内应用中,mRNA 5'末端添加7-甲基鸟苷帽对于RNA的稳定、有效翻译、核转运和剪接是非常必要的。对于大多数研究应用而言,加帽的RNA也是必须的。RNA加帽可以通过使用帽子类似物共转录或使用加帽酶转录后修饰。两种方法都能产生适用于注射、体外翻译和其他应用的功能性加帽RNA。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Nucleic Acids Res. 7:1931 (1979) Cloning and characterization of the T7 promoter
Methods Mol Biol. 703:29 (2011) Protocols for the synthesis of RNA by in vitro transcription
J Vis Exp. 61:3702 (2012) ping, and transfection of mRNA
Protein Expr Purif. 9:142 (1997) Protocol for expression and purification of T7 RNAP for in vitro transcription
亮点

我们的mRNA体外转录载体能高效用于T7 RNAP介导的体外转录。该载体在大肠杆菌中具有高拷贝复制能力,易于酶切,有助于大量生成mRNA。

优势

效率高:T7 RNAP是高效酶,其介导的体外转录可大量产生功能性RNA。

技术简单:操作简便,比在细胞中表达mRNA容易,且在细胞中表达mRNA还需要进行转染和细胞培养。

不足之处

方向特定:该载体系统只含有单个体外转录启动子,如需要有义和反义转录物,则需要两个载体。

失控转录:为了产生正确有效的转录产物,在进行转录反应之前需要通过限制性内切酶线性化质粒模板。

载体关键元件

T7 promoter: A promoter for the RNA polymerase from T7 bacteriophage. Drives high-level transcription of the downstream sequence of interest.

Transcribed sequence: Your DNA sequence of interest to be transcribed into RNA is placed here.

poly(A): Thirty base poly(A) track. Adds stability to the transcribed mRNA.

SapI, BsiWI, AscI: Unique restriction endonuclease sites that can be used to linearize the plasmid prior to in vitro transcription.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.