哺乳动物基因普通表达PiggyBac转座载体

概述

PiggyBac载体系统可以非常高效地把外源DNA插入哺乳动物细胞的基因组,该系统技术简单,可利用质粒转染(非病毒转导)把您所感兴趣的基因长期稳定地整合到靶细胞基因组。

该系统来源于PiggyBac转座子,最开始在粉纹夜蛾(Trichoplusia ni) 中发现并分离而来。基于序列同源性分析,PiggyBac转座子是许多常见物种共有的一类转座子。

PiggyBac系统包含两个载体,一个载体被称为辅助质粒,负责编码转座酶;另一个载体被称为转座子质粒,包含两个末端重复序列(TRs)以及两者之间的被转座区域,需要被转座到宿主基因组中的目的基因就克隆在这个区域。

当辅助质粒和转座子质粒共转染靶细胞时,辅助质粒产生的转座酶将会识别转座子的两个TR元件,然后将被转座区和两个TR元件插入到宿主基因组中。转座插入通常发生在包含TTAA序列的宿主染色体位点,并在转座子两侧出现TTAA重复序列。

PiggyBac属于II类转座子,通过“剪切—粘贴”的机制移动,从一个地方转座到另一个地方,而不留下序列本身(恰好相反,I类转座子是通过“复制—粘贴”的方式移动)。由于辅助质粒是通过瞬时转染进入宿主细胞的,故会逐渐丢失。随着辅助质粒的丢失,转座子在宿主基因组中变成了永久整合。当这些宿主细胞再次被辅助质粒转染,整合的转座子会再次通过“剪切—粘贴”的机制移动。

关于PiggyBac基因表达载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Mol Cell Biochem. 354:301 (2011) Review
Cell. 122:473 (2005) Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice

亮点

我们的PiggyBac转座子载体与辅助质粒是经过优化的,可在大肠杆菌中高拷贝复制。该载体系统对多种类型的靶细胞均具有高效的转导效率,实现外源基因的高水平表达。

优势

外源基因的永久整合:常规质粒转染只能实现外源基因的瞬时表达,这种外源基因会随着宿主细胞的分裂而不断丢失,在快速分裂的细胞中显得尤为显著。相反,将PiggyBac转座子载体和辅助质粒一起转染到哺乳动物细胞中,由于转座子在转座酶的作用下,目的基因能稳定地整合到宿主细胞的染色体中,从而实现转座子载体上携带的目的基因在宿主细胞中永久表达。

技术简单:通过常规转染即可把质粒转入细胞,相比起病毒载体需要进行病毒包装,过程更简单。

载体容量大:我们的转座子载体总容量可达30 kb,其中质粒骨架只占3 kb,有足够大的容量可以放置客户所感兴趣的序列。

不足之处

转染细胞类型受限:PiggyBac载体进入细胞依赖于转染。不同类型的细胞,其转染效率差异非常大。非分裂细胞通常比分裂细胞更难转染,原代细胞比永生化细胞更难转染,一些重要的细胞类型转染难度更大,如神经元和胰岛β细胞。另外,质粒转染主要局限于体外应用,很少应用于体内实验(但可以应用于转基因动物模型制备)。以上因素在一定程度上制约了PiggyBac系统的应用。

载体关键元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the piggyBac transpose can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome.

Promoter: The promoter driving your gene of interest is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

rBG pA: Rabbit β-globin polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.