哺乳动物基因普通表达MMLV逆转录病毒载体

概述

MMLV逆转录病毒基因表达载体系统是一种非常高效的,能把外源基因稳定整合到哺乳动物细胞基因组的系统,也是在iPS细胞制备中特别受欢迎的基因转导方法。

MMLV逆转录病毒载体来源于莫洛尼(氏)鼠白血病病毒,属于逆转录病毒家族,野生型逆转录病毒基因组是线性双正链RNA。

MMLV逆转录病毒重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中,位于两个长末端重复序列(LTRs)之间的DNA片段会被转录成RNA,由辅助质粒表达的病毒蛋白将其包装形成病毒颗粒。包装后的活体病毒将会被释放到上清液中,可以直接收集或进一步浓缩病毒转染靶细胞。

当病毒转导靶细胞时,释放到宿主细胞中的病毒RNA借助逆转录酶逆转录成DNA,然后随机整合进宿主细胞的基因组中。在病毒载体中,位于两个LTR的DNA片段和病毒基因组都会稳定整合到靶细胞的基因组中。

通过改造优化,我们的MMLV逆转录病毒载体删除了与病毒包装和转导相关的基因(这些基因由辅助质粒进行表达,用于病毒包装过程)。因此,通过逆转录病毒载体包装产生的病毒是复制缺陷型的(只能转导靶细胞而不能自我复制),具有非常高的生物安全性。

关于MMLV逆转录病毒基因表达载体的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Exp Hematol. 31:1007 (2003) Review
J Virol. 61:1639 (1987) Extended packaging signal increases the titer of MMLV vectors
Gene Ther. 7:1063 (2000) Tropism of MMLV vectors depends on packaging cell lines
Nat Protoc. 6:346 (2011) Tropism of MMLV vectors depends on packaging plasmids

亮点

经优化,该载体在大肠杆菌体内具有很高的拷贝数,包装的活病毒具有很高的滴度,对大多数宿主细胞具有高效的转导能力,能有效地把载体整合到靶细胞基因组并实现外源基因的高水平表达。

优势

外源基因的稳定整合:常规质粒转染只能实现外源基因的瞬时表达,这种外源基因会随着宿主细胞的分裂而不断丢失,在快速分裂的细胞中显得尤为显著。相反的是,MMLV逆转录病毒转导的目的基因能稳定地整合到宿主细胞的染色体组中 ,因而会随着宿主细胞的分裂而稳定遗传。

宿主范围广泛:我们的病毒包装系统包装出来的病毒含有VSV-G包膜蛋白,此蛋白拥有非常广泛的亲和性,可以转导来源于人、小鼠和大鼠等常用的哺乳动物细胞和其它类型的细胞,但不能转导非分裂细胞(见下文不足之处)。

载体容量大:野生型的逆转录病毒基因组大小约为8 kb,而在我们的逆转录病毒载体中,病毒包装和转导的必要元件约为2.5 kb,余下5.5 kb的空间容纳客户的目的序列。由于我们的载体只允许插入一个ORF,该装载空间可以适用于绝大部分序列。

高水平表达:5' LTR包含了一个非常强的启动子,能使目的基因高水平表达。

基因拷贝数相对均一:通常情况下,采用病毒转导的方式可以比较均一的将外源基因转入靶细胞中,而传统的质粒转染则呈现出较高的不均一性,导致某些细胞会获得较多拷贝质粒而某些则会获得较少甚至完全没有。

体内外实验均有效:我们的载体不仅拥有良好的体外细胞转导能力,同样适用于体内活体动物实验。

安全性:为了确保载体的安全性,我们将病毒包装和转导所必需的基因由三个辅助质粒分别表达或者整合到包装细胞基因组中进行表达。因此,利用我们的载体包装出来的活性病毒是复制缺陷型的。

不足之处

依赖于5’ LTR启动子:载体中目的基因的表达依赖于5’ LTR广泛性启动子,而慢病毒载体允许用户灵活使用启动子来驱动目的基因的表达。

中等病毒滴度:在没有进一步浓缩的情况下,包装逆转录病毒细胞的上清液中,病毒滴度接近107/ml,比慢病毒载体的滴度要低大约一个数量级。

难以转导非分裂细胞:我们的MMLV逆转录病毒基因表达载体难以转导非分裂细胞。

技术复杂:使用MMLV逆转录病毒载体时,需要在包装细胞中产生活病毒,然后测定病毒滴度。这些过程相对于常规质粒转染,技术难度更高,周期更长。

载体关键元件

5' MoMuLV LTR: MMLV retrovirus 5' long terminal repeat. In wildtype MMLV retrovirus, 5' LTR and 3' LTR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome and point in the same direction. Upon viral integration, the 3' LTR sequence is copied onto the 5' LTR. The LTRs carry both promoter and polyadenylation function, such that the 5' LTR acts as a promoter to drive the transcription of the viral genome, while the 3' LTR acts as a polyadenylation signal to terminate the upstream transcript.

ψ plus pack2: MMLV retrovirus packaging signal required for the packaging of viral RNA into virus.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here. Its expression is driven by the ubiquitous promoter function in the 5' LTR.

3' MoMuLV LTR: MMLV retrovirus 3' long terminal repeat. The polyadenylation signal contained in 3' LTR serves to terminates the transcript from the upstream ORF.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.