学习中心
载体系统指南
VECTOR SYSTEM GUIDE

哺乳动物基因表达MSCV载体

概述

MSCV(Murine stem cell virus,鼠干细胞病毒)逆转录病毒载体系统是一种非常高效的、能在胚胎干细胞(ES)、胚胎癌细胞(EC)、造血干细胞(HS)及其他哺乳动物细胞系中大量表达目的基因的病毒工具。

MSCV逆转录病毒载体衍生于MESV和LN两种逆转录病毒载体,这两种载体分别是基于鼠PCC4细胞骨髓增生性肉瘤病毒 (PCMV)和莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)。MSCV包含一个延伸的杂合包装信号,该信号源于LN载体,同传统的逆转录病毒载体相比,病毒滴度更高。此外,MSCV逆转录病毒载体包含PCMV病毒来源的经过设计的5’LTR,有助于靶基因在ES细胞、EC细胞等多能细胞系中的转录激活,克服了目的基因在此两种细胞中抑制性表达的现象,而该现象通常能在MMLV逆转录病毒载体中观察到。

MSCV逆转录病毒载体首先构建成大肠杆菌质粒。随后同辅助质粒一起被转染到包装细胞中。在包装细胞内,位于两个长末端重复序列(LTRs)之间的载体DNA转录成RNA,辅助质粒表达病毒蛋白将RNA包装成病毒。之后,活病毒分泌到上清中,可用于直接或者浓缩后感染靶细胞。

将病毒加入靶细胞后,RNA穿梭进入细胞,反转录成DNA并随机整合到宿主基因组中。载体构建时插入两个LTRs之间的序列随同其余病毒基因组被永久整合到宿主DNA中。

经过改造,MSCV逆转录病毒载体缺乏病毒包装和转导必需的基因(这些基因由辅助质粒携带、或者整合到包装细胞中)。因此,由该载体产生的病毒由于复制缺陷而具有非常高的生物安全性(这意味着,该病毒只能转导靶细胞而不能在其中复制)。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献主题
Gene Ther. 1:136 (1994)Development of the MSCV vector series
Proc Natl Acad Sci U S A. 87:9202 (1990)Development of the MESV retroviral vector
Biotechniques 7:980 (1989)Development of LNL6 retroviral vectors
Proc Natl Acad Sci U S A. 83:3292 (1986)Characterization of retroviral mutants expressed in EC cells
亮点

我们的载体系统经优化后,能在大肠杆菌中高拷贝复制,活病毒包装滴度高,能有效的转导包括ES、EC和HS细胞在内的广泛细胞,且能有效整合到宿主基因组并进行转基因的高水平表达。

优势

载体DNA稳定整合: 由于DNA会随着时间而流失,因此,传统的质粒转染几乎都是瞬时将DNA传递到宿主细胞中。该问题在快速分裂的细胞中尤其显著。相反,逆转录病毒由于能将病毒载体整合到宿主基因组中,因此传递的基因能在宿主细胞中稳定存在。

宿主范围广:我们的包装系统将VSV-G衣壳蛋白添加到病毒表面。该蛋白就有广泛的亲和性。因此,能用于转导来源于常规哺乳动物的细胞,包括人、小鼠和大鼠。此外,MSCV中存在源于PCMV的5’LTR元件,经设计改造,有助于靶基因在ES、EC和HS细胞中高水平表达。这明显优于MMLV逆转录病毒载体,因为在ES和EC细胞中,MMLV载体表现出目的基因的表达抑制。尽管如此,针对非分裂的细胞,我们的MSCV载体同样表现出了转导困难(见下文不足之处)。

载体容量大:MSCV逆转录病毒载体的容量~8 Kb。在我们的载体中,病毒包装和转导必需元件~1.9 Kb,剩余可容纳目的DNA范围~6.1 Kb。由于我们的载体设计仅用于插入ORF,该载体能够满足大多数需求。

表达水平高: 5' LTR包含一个强的广泛表达启动子,能够启动目的基因高水平表达。

基因拷贝数相对均一:通常情况下,病毒转导能够以一种相对均一的形式将载体传递到细胞中。相反,传统的质粒载体转染不均一性较高,造成了DNA拷贝数在一些细胞中较高,而在另一些细胞中则较少或者没有。

体内外实验均有效:我们的载体不仅拥有良好的体外细胞转导能力,同样适用于动物实验。

安全:我们将病毒包装和转导所需的基因分别置于几个辅助质粒或者整合到包装细胞中,因此由我们的载体所产生的活病毒没有复制能力。

不足之处

依赖于5' LTR启动子:在我们的载体中,目的基因的表达依赖于为5’LTR的启动子功能区。这明显不如允许添加所需的启动子驱动目的基因表达的慢病毒载体。

病毒滴度适中:我们的载体包装病毒滴度在未进一步浓缩的包装细胞上清中能达到107 TU/ml。相比于我们的慢病毒载体,低了一个数量级。

非分裂细胞转导困难:我们的载体难以转导非分裂细胞。

技术复杂:MSCV逆转录病毒载体需要在包装细胞中产生活毒,然后进行病毒滴度检测。同传统的质粒转染相比,该方法技术要求高且较为耗时。

载体关键元件

5' LTR: 5' long terminal repeat from PCC4-cell-passaged myeloproliferative sarcoma virus (PCMV). The LTRs carry both promoter and polyadenylation function, such that the 5' LTR acts as a promoter to drive the transcription of the viral genome, while the 3' LTR acts as a polyadenylation signal to terminate the upstream transcript. The 5’LTR derived from the PCMV retrovirus in the MSCV vector has been strategically modified to drive the transcriptional activation of target genes in pluripotent cell lines such as ES or EC cells, unlike MMLV retroviral vectors.

MESV ψ: Murine embryonic stem cell virus packaging signal required for the packaging of viral RNA into virus.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here. Its expression is driven by the ubiquitous promoter function in the 5' LTR.

3' LTR: 3' long terminal repeat from PCC4-cell-passaged myeloproliferative sarcoma virus (PCMV). Allows packaging of viral RNA into virus. Also facilitates transcription termination and mRNA polyadenylation in ES cells and other cell types.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.