哺乳动物单gRNA表达慢病毒载体

概述

CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9)核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一(另外两种是ZFN和TALEN),可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。

慢病毒single gRNA表达载体系统可以在转导的细胞内表达单个引导RNA(gRNA),当与Cas9核酸酶共表达时,可编辑基因组中特定靶位点的DNA序列。该载体需要与另一种编码Cas9核酸酶的载体一起使用。

Cas9是RNA引导DNA核酸酶,是天然原核免疫系统的一部分,赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内,Cas9核酸酶与引导RNA(gRNA)形成复合物,该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用,gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上,然后切割基因组中的靶位点。为了方便使用,我们设计的CRISPR/Cas9载体能够在一个载体上同时有效表达Cas9核酸酶(或缺刻酶)和引导RNA(gRNA)。

常用的Cas9核酸酶有两种,一种是标准的人源化Cas9(hCas9),能够有效地在靶位点产生双链断裂(DSBs);另一种是“缺刻酶”(Cas9_D10A),仅在DNA中产生单链切割。如果将Cas9_D10A缺刻酶与靶向两条互补链的两个gRNA一起使用,缺刻酶会在两条链上产生单链切割,从而导致靶位点处产生DSB。这种方法通常会减少CRISPR/Cas9脱靶效应,因为它需要两个gRNA同时靶向靶位点。

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细胞通过非同源末端连接途径(NHEJ)修复通常会产生小的片段或碱基缺失,插入和碱基置换等突变。当这些突变破坏蛋白质编码区(例如引起移码缺失)时,会引起功能性基因敲除。在少数情况下,CRISPR/Cas9载体和外源供体DNA模板共同导入细胞时,细胞会通过同源性修复(HDR)机制来修复DSB,靶基因DNA序列会被模板序列取代,碱基发生改变,如点突变等。缺刻基因组DNA也会经常发生同源修复(HDR),如将外源模板DNA与Cas9_D10A缺刻酶一起导入细胞中,有可能产生碱基改变。

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利用CRISPR/Cas9系统可以有效靶向大部分DNA序列,而NGG(有时是NAG)是必须的。NGG叫做前间区序列邻近基序(PAM),位于靶DNA,gRNA识别序列的3'末端。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Science 339:819-23 (2013) Description of genome editing using the CRISPR/Cas9 system
Cell. 154:1380–9 (2013) Use of Cas9 D10A double nicking for increased specificity
Nat. Biotech. 31:827–832 (2013) Specificity of RNA-guided Cas9 nucleases
J Virol. 72:8463 (1998) The 3rd generation lentivirus vectors
J Virol. 72:9873 (1998) Self-inactivating lentivirus vectors
Science. 272:263 (1996) Transduction of non-dividing cells by lentivirus vectors
Curr Gene Ther. 5:387 (2005) Tropism of lentiviral vectors
J Virol. 77:4685 (2003) Impact of cPPT on lentivirus vector transduction
Nat Protoc. 1:241 (2006) Production and purification of lentiviral vectors

亮点

我们的慢病毒single gRNA表达载体可以用于快速高效靶向细胞基因组,并在靶位点并产生碱基缺失等突变。为了在特定的靶位点引入突变,需要与靶DNA序列匹配的gRNA序列以及核酸酶hCas9(产生DSB)或其变体Cas9_D10A缺刻酶(单链切割)。核酸酶须由另一个载体表达。

优势

外源基因的稳定整合:常规质粒转染只能实现外源基因的瞬时表达,这种外源基因会随着宿主细胞的分裂而不断丢失,在快速分裂的细胞中显得尤为显著。相反的是,慢病毒转导的目的基因能稳定地整合到宿主细胞的染色体中 ,因而会随着宿主细胞的分裂而稳定遗传。

简单易懂:gRNA和靶位点之间的简单同源关系使得CRISPR/Cas9系统简单且易于设计。

滴度高:我们的病毒载体可以包装出高滴度的病毒。我们提供的病毒包装服务,病毒滴度可以达到>108 TU/ml。在这样的病毒滴度下,如果选择合适的剂量去转导体外培养的哺乳动物细胞,则转导效率可接近100%。

宿主范围广泛:我们的病毒包装系统包装出来的病毒含有VSV-G包膜蛋白,此蛋白拥有非常广泛的亲和性,可以转导几乎所有的哺乳动物细胞,包括分裂细胞,非分裂细胞,原代细胞,稳定细胞系,干细胞,分化细胞,贴壁细胞和悬浮细胞等各类哺乳动物细胞,甚至还可以转导一些非哺乳动物细胞。使用传统的转染方式转导神经元细胞是非常难的,但是采用我们慢病毒载体系统可以轻易的实现神经元细胞的转导。相对于在某些细胞中具有较低转导效率的腺病毒和不能用于非分裂细胞的逆转录病毒而言,利用我们的慢病毒包装系统包装出来的病毒具有广泛的亲和性。

病毒颗粒能够浓缩:我们的病毒包装系统将VSV-G包膜蛋白添加到病毒表面,这种蛋白质结构稳定,使得病毒颗粒可以通过高速离心进一步浓缩。

基因拷贝数相对均一:通常情况下,采用病毒转导的方式可以比较均一的将外源基因转入靶细胞中,而传统的质粒转染则呈现出较高的不均一性,导致某些细胞会获得较多拷贝质粒而某些则会获得较少甚至完全没有。

体内外实验均有效:我们的载体不仅拥有良好的体外细胞转导能力,同样适用于体内活体动物实验。

安全性:我们的病毒载体系统具备了以下两大特点,因而具有非常高的安全性。一、病毒包装和转导所必需的基因由三个辅助质粒分开表达。二、5' LTR的启动子自失活。因此,在进行病毒包装和病毒转导的时候不会产生具有复制能力的病毒颗粒,使用我们的载体对人体的健康威胁也是最低的。

不足之处

技术复杂:使用慢病毒载体时,需要在包装细胞中产生活病毒,然后测定病毒滴度。因此慢病毒转染相对于常规质粒转染,技术难度更高,周期更长。

需要单独表达核酸酶的载体或病毒:我们的慢病毒single gRNA载体只表达gRNA或和筛选标记。该载体系统必须与表达Cas9核酸酶的载体或病毒一起使用才能实现基因组编辑。

具有脱靶效应:已有文献报道CRISPR/Cas9具有脱靶效应,通常TALEN系统比CRISPR/Cas9具有更低的脱靶活性。通过将Cas9_D10A缺刻酶与两种gRNA结合使用(如上所述),可以显著降低脱靶效应。

PAM要求:CRISPR/Cas9靶位点必须包含NGG序列(使用较多),也叫做PAM序列,位于gRNA识别序列3'末端。

Key components

RSV promoter: Rous sarcoma virus promoter. It drives transcription of viral RNA in packaging cells. This RNA is then packaged into live virus.

Δ5' LTR: A deleted version of the HIV-1 5' long terminal repeat. In wildtype lentivirus, 5' LTR and 3' LTR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome and point in the same direction. Upon viral integration, the 3' LTR sequence is copied onto the 5' LTR. The LTRs carry both promoter and polyadenylation function, such that in wildtype virus, the 5' LTR acts as a promoter to drive the transcription of the viral genome, while the 3' LTR acts as a polyadenylation signal to terminate the upstream transcript. On our vector, Δ5' LTR is deleted for a region that is required for the LTR's promoter activity normally facilitated by the viral transcription factor Tat. This does not affect the production of viral RNA during packaging because the promoter function is supplemented by the RSV promoter engineered upstream of Δ5' LTR.

Ψ: HIV-1 packaging signal required for the packaging of viral RNA into virus.

RRE: HIV-1 Rev response element. It allows the nuclear export of viral RNA by the viral Rev protein during viral packaging.

cPPT:  HIV-1 Central polypurine tract. It creates a "DNA flap" that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection. This improves vector integration into the host genome, resulting in higher transduction efficiency.

U6 Promoter: This drives high level expression of the gRNA.

gRNA: Allow in vitro transcription for RNA preparation. Scaffold gRNA sequence is included.

Terminator: Terminates transcription of the gRNA.

hPGK promoter: Human phosphoglycerate kinase 1 gene promoter. It drives the ubiquitous expression the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

WPRE: Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element. It enhances transcriptional termination in the 3' LTR during viral RNA transcription, which leads to higher levels of functional viral RNA in packaging cells and hence greater viral titer. It also enhances transcriptional termination during the transcription of the user's gene of interest on the vector, leading to their higher expression levels.

ΔU3/3' LTR: A truncated version of the HIV-1 3' long terminal repeat that deletes the U3 region. This leads to the self-inactivation of the promoter activity of the 5' LTR upon viral vector integration into the host genome (due to the fact that 3' LTR is copied onto 5' LTR during viral integration). The polyadenylation signal contained in ΔU3/3' LTR serves to terminates all upstream transcripts produced both during viral packaging and after viral integration into the host genome.

SV40 early pA: Simian virus 40 early polyadenylation signal. It further facilitates transcriptional termination after the 3' LTR during viral RNA transcription during packaging. This elevates the level of functional viral RNA in packaging cells, thus improving viral titer.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.