重组蛋白原核冷诱导表达载体pCS

概述

pCS载体系统是用于在大肠杆菌中低温(通常15℃)高效表达重组蛋白的系统。该载体系统基于大肠杆菌冷休克基因cspA和部分lac操纵子,是pET和pBAD系统(两者是在37℃表达)的补充。

温度与重组蛋白质的折叠有关,从而影响蛋白的溶解度和稳定性。因此,许多在37℃下溶解度和稳定性较差的蛋白,能在较低温度下有所改善。当重组蛋白37°C诱导表达的pET或pBAD载体系统中表达困难时,pCS系统可能是一种非常有用的替代方法。

将目的基因置于pCS载体中cspA启动子、lac操纵子(LacO)和cspA的5'UTR和短翻译增强元件(TEE)的下游。

由于在37℃下5'UTR非常不稳定,cspA启动子在此温度下的转录非常低效。但当将宿主菌转移至15℃时,5'UTR会形成高度稳定的二级结构。TEE序列可以通过核糖体的捕获来增强目的基因的翻译起始。

该质粒还携带有LacI天然启动子和编码序列,LacI蛋白作用于邻近cspA启动子的LacO序列以阻断目的基因的转录。在不存在IPTG的情况下,这种抑制作用可以阻止下游基因的泄漏表达,而加入IPTG则会阻断LacI的抑制作用。IPTG和低温可以有效地诱导目的基因的表达。

关于该系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Nat Biotechnol. 22:877 (2004) Cold-shock induced high-yield protein production in E. coli
J. Biol. Chem. 274:10079-85 TEE sequence translation enhancement

亮点

在37℃缺乏IPTG的情况下,pCS载体的大肠杆菌可以在生长培养基中稳定存在。通过添加IPTG,去除LacI的抑制作用,并将温度转换到15℃来激活cspA启动和稳定cspA 5’-UTR的构象,从而诱导目的基因的表达。当目的重组蛋白不能利用pET或者pBAD系统进行表达时,该系统可以作为替代选择。一些37°C中不稳定的蛋白或者冷稳定蛋白也推荐使用该系统进行表达。

优势

表达严谨:在不存在IPTG的情况下,pCS载体上的目的基因被强烈抑制;当加入IPTG和温度降至15℃进行诱导时,目的基因高水平表达。

低温表达:pCS载体系统允许在低温下表达重组蛋白,这对于许多不能在其他细菌表达系统正常表达的蛋白来说是一个优势。

宿主要求:与需要特定重组蛋白表达宿主菌的pET或pBAD载体系统不同,pCS可在克隆宿主(通常是Stbl3)中产生重组蛋白。但是,因为BL21菌株能够减少蛋白降解,所以通常作为蛋白表达的推荐宿主。

不足之处

表达水平次于pET载体:基于pCS载体系统的重组蛋白水平低于pET载体系统。

关键载体元件

cspA promoter: Promoter of the cold-shock gene cspA. It drives transcription of the gene of interest at 15°C.

LacO: Binding site for LacI. This element inhibits activity of the cspA promoter when LacI protein is present, preventing leaky expression of the gene of interest.

cspA 5’ UTR: 5’ untranslated region of the cspA gene, which destabilizes the mRNA at 37°C and becomes highly stable at 15°C.

TEE: Translation enhancing element. This sequence is preferentially bound by ribosomes initiating translation, so once bound to the TEE, ribosomes are rarely available to translate other mRNAs.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

cspA 3’ UTR: 3’ untranslated region of the cspA gene.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

LacI: The E. coli natural promoter and coding sequence for the lac repressor. Without IPTG present, the LacI protein represses transcription of the gene of interest from the cspA promoter due to the LacO site adjacent to the cspA promoter.