重组蛋白真核表达杆状病毒转移载体(单启动子系列)

概述

杆状病毒载体系统广泛应用于昆虫细胞中表达重组蛋白,它是真核表达重组蛋白最通用和最强大的系统之一。该系统特别有利于在真核宿主细胞中大规模制备重组蛋白。许多真核生物蛋白的翻译后修饰只能在真核细胞中发生(例如糖基化),或者需要真核细胞环境来进行正确折叠(例如膜蛋白质),而原核蛋白表达系统却没有这些功能。

杆状病毒是一种双链DNA病毒,通常会感染昆虫,特别是鳞翅目昆虫(moths, butterflies and skippers)。我们的克隆载体pBV是经优化的,可与来自AcMNPV(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus)的穿梭载体(称为Bacmid)一起使用,该穿梭载体的野生型基因组大小为134 kb。

首先将目的基因克隆到含有强启动子的pBV载体上,目的基因表达盒与庆大霉素抗性基因的侧翼序列为Tn7转座子末端元件Tn7L和Tn7R。然后,将该载体转化到携带Bacmid穿梭载体和辅助质粒的大肠杆菌中。Bacmid穿梭载体是一个非常大的质粒,含有经修饰后携带lacZ基因的杆状病毒基因组和插入lacZ基因编码区的mini-attTn7位点。辅助质粒可以表达Tn7转座酶,由转座酶介导pBV载体上Tn7R和Tn7L的之间的区域转座到mini-attTn7位点,Tn7R和Tn7L的之间的区域是目的基因和庆大霉素抗性基因的表达盒。通过庆大霉素筛选和蓝/白筛选鉴定出重组的阳性克隆(由于lacZ表达,非重组菌落为蓝色,而由于转座子插入破坏lacZ,重组菌落为白色),纯化的重组Bacmid DNA可用于转染昆虫细胞以产生活的杆状病毒,进而产生目的重组蛋白。

最常用的杆状病毒重组蛋白表达细胞系是Sf9,来源于草地贪夜蛾(fall armyworm)的卵巢组织。该细胞系适用于各种培养条件,包括悬浮或单细胞培养以及无血清培养基。幼虫和其他鳞翅目细胞系也被广泛使用,也有一些关于杆状病毒可应用于哺乳动物细胞的报道。

有关该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
J Virol. 67:4566-79 (1993) Generation of recombinant baculovirus by site-specific transposon-mediated insertion
Meth. Mol Med. 13:213-35 (1998) Generation of recombinant baculovirus DNA in E.coli using a baculovirus shuttle vector
Nat Biotech. 23: 567–575 (2005) Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells

亮点

我们的杆状病毒重组蛋白表达载体系统能够在昆虫细胞中高效生产重组蛋白,该系统表达的蛋白具有真核细胞的翻译后加工特征,且能够进行大规模生产应用。

优势

真核系统:昆虫细胞可进行类似于哺乳动物细胞的蛋白翻译后加工。因此,我们的系统特别适用于表达需要进行适当的转录后加工的真核生物蛋白,而原核表达系统并不具备这一功能,如共价修饰或膜定位。

高水平表达和可溶性:在大多数情况下,目的蛋白是高度表达的,可溶性的,并且可以很容易地从感染细胞中进行纯化回收。

易于放大规模:在我们的系统中,获得的初始杆状病毒可用于感染更多细胞以进一步提高病毒滴度。因此,利用我们的系统易于放大蛋白生产规模。

悬浮培养:Sf9和其他鳞翅目细胞系易于悬浮培养,使其能够在生物反应器中大规模生产重组蛋白。

安全性:杆状病毒不能在除了昆虫细胞以外的细胞进行复制,对哺乳动物和植物无致病性。因此,可以在最小生物安全条件下使用我们的杆状病毒重组蛋白表达系统。

不足之处

技术复杂:使用杆状病毒表达系统进行蛋白生产需要多个步骤,包括将目的基因克隆到pBV载体上,产生重组Bacmid,并将重组Bacmid DNA转染昆虫细胞。相对于细菌重组蛋白表达系统,该系统对技术要求更高,且耗时更久。在订购载体的同时,可以通过订购我们的重组Bacmid制备和病毒包装服务轻松解决这些问题。

载体关键元件

PH promoter: AcMNPV polyhedrin promoter. It drives high-level expression of the gene encoding your recombinant protein.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 early pA: Simian virus 40 early polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

Tn7L: Tn7 transposon left terminal element. It is recognized by Tn7 transposase. DNA flanked by Tn7R and Tn7L can be transposed by Tn7 transposase into attTn7 docking sites.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Tn7R: Tn7 transposon right terminal element. It is recognized by Tn7 transposase. DNA flanked by Tn7R and Tn7L can be transposed by Tn7 transposase into attTn7 docking sites.

Gentamicin: Gentamicin resistance gene. It allows for drug selection of E. coli carrying recombinant bacmids.