重组蛋白原核arabinose诱导表达载体pBAD

概述

pBAD载体系统是用于在细菌中表达重组蛋白的可靠且可控的系统,该系统通过araBAD操纵子控制大肠杆菌L-阿拉伯糖的代谢。将目的基因置于pBAD载体中araBAD启动子的下游,当L-阿拉伯糖存在时,araBAD启动子驱动目的基因的高效表达;当葡萄糖存在时,目的基因的表达则被抑制。该载体系统可精确控制目的基因的表达,特别适用于生产困难蛋白,如具有毒性或不溶性蛋白。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
J Bacteriol. 177:4121-30 (1995) Development of pBAD vectors

亮点

首先,将目的基因克隆到pBAD载体上,并将携带该质粒的菌株在缺乏L-阿拉伯糖的生长培养基中培养以降低质粒不稳定性。然后,通过向培养基中加入L-阿拉伯糖来诱导目的基因的表达。

我们的pBAD载体上携带的双向araBAD启动子可同时驱动目的基因和调节蛋白AraC的表达。在缺少L-阿拉伯糖的情况下,AraC在启动子区域二聚化形成环阻断转录。当添加L-阿拉伯糖时,AraC改变构象并结合到启动子中的替代位点,从而激活转录。

向生长培养基中添加葡萄糖,宿主细胞cAMP水平降低,可以进一步抑制目的基因的本底表达。在无葡萄糖的培养基中,cAMP水平很高,cAMP-CRP(代谢物激活蛋白)复合物会与pBAD启动子结合,从而抑制目的基因的表达,这将有利于表达具有细胞毒性或抑制细菌生长的目的基因的表达。

所有定制的pBAD载体都会克隆在能够保持质粒稳定的大肠杆菌中(如Stbl3),可将质粒转移至缺乏L-阿拉伯糖分解代谢基因的宿主菌株(如TOP10)中,使目的基因有效且稳定的表达,因为L-阿拉伯糖的浓度不会随着时间的推移降低。对于需要利用葡萄糖严格抑制本底表达的,则应该使用LMG194宿主菌株。该菌株能够在基础培养基(RM培养基)上生长,可通过葡萄糖进一步抑制araBAD启动子。

优势

表达高度严谨:pBAD载体系统比pET载体系统的表达更严谨。在缺少L-阿拉伯糖的情况下,目的基因可能只有非常低的本底表达,但可通过葡萄糖进一步抑制。

诱导强度高:araBAD操纵子系统是高度可诱导的。在去除葡萄糖并添加L-阿拉伯糖后,可实现>1000倍的诱导效率。

诱导成本低:L-阿拉伯糖价格低廉,大规模蛋白表达经济实惠。

宿主要求:与pET载体不同,pBAD载体可以稳定存在于表达菌株中,如TOP10。

不足之处

表达水平次于pET载体:基于pBAD载体系统的重组蛋白水平低于pET载体系统。

诱导物代谢:野生型大肠杆菌可分解L-阿拉伯糖。当表达目的蛋白时,应该使用L-阿拉伯糖分解代谢突变的宿主菌株(如TOP10或LMG194),以避免由于培养基中L-阿拉伯糖的降解而引起表达不稳定。

载体关键元件

araBAD promoter: Drives transcription of the gene of interest when L-arabinose is present and glucose is absent. This promoter also controls AraC expression.

RBS: The ribosome-binding site and translation initiation element from T7 bacteriophage. This allows for efficient production of the protein of interest.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

rrnB terminator: Signal sequence to terminate the transcript made from the gene of interest, preventing run-on transcription.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in medium copy numbers in E. coli.

araC: Encodes the regulatory protein of the E. coli araBAD operon. AraC inhibits expression from the araBAD promoter in the absence of L-arabinose or the presence of glucose, and activates transcription in the presence of L-arabinose and the absence of glucose.