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载体指南

哺乳动物基因FLEX条件性表达腺病毒载体(Cre-On)

概述

FLEX介导条件性表达腺病毒载体结合了载体家的高效的腺病毒载体系统和Cre响应的FLEX条件性基因表达载体,可以帮助您实现在多种多样的哺乳动物细胞中以腺病毒转导Cre响应的FLEX基因表达调控开关。FLEX Cre-On系统利用位于目的基因两侧的Lox-变体重组位点,在Cre重组酶的调控下目的基因发生反转,目的基因正常表达;而Cre不存在的情况下,目的基因不表达。

FLEX Cre-On系统由两对异型Lox-变体重组位点组成,其中野生型序列称为LoxP,突变体称为Lox2272,分别位于反向基因ORF(相对启动子方向而言)的两侧。 两种Lox-变体都可被Cre识别,但只有相同的Lox位点对可以彼此重组,与其他Lox-变体不能进行重组。 LoxP和Lox2272位点以交替方式位于ORF两端,每对位点互为反向。Cre重组酶不存在的情况时,目的基因由于其编码方向与启动子方向相反,所以不发生表达;在Cre的存在下,LoxP和Lox2272位点对分别重组,导致ORF方向反转为正向,且其中的一对重组位点将具有相同的方向,Cre会介导产生正向重组切割,继而分别留下一个不同的重组位点。 ORF的方向反转,使得目的基因可以在启动子的驱动下正常表达。由于ORF侧翼是两个不同的Lox-变体位点,所以即使存在Cre也不会进一步发生重组。

腺病毒载体首先是以质粒的方式构建并使用E. coli扩增,然后线性化后转染进入包装细胞。在包装过程中,位于两个反向重复序列(ITR)之间的DNA片段与由包装细胞表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。对于上述的FLEX介导的Cre-On条件性表达腺病毒载体,FLEX Cre-On开关位于两个ITR之间。当病毒转导宿主细胞时,载体并以游离DNA的形式存在于细胞核中。

通过改造优化,我们的腺病毒载体缺失了E1A、E1B和E3区,前两者与病毒包装相关(这两个基因已被整合到包装细胞的基因组中)。因此,运用我们的病毒载体包装出来的病毒是复制缺陷型的(只能转导靶细胞而不能自我复制),大大提高了生物安全性。

 

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Proc Natl Acad Sci U S A. 91:8802 (1994) The 2nd generation adenovirus vectors
J Gen Virol. 36:59 (1977) A packaging cell line for adenovirus vectors
J Virol. 79:5437 (2005) Replication-competent adenovirus (RCA) formation in 293 Cells
Gene Ther. 3:75 (1996) A cell line for testing RCA
Gene. 216:55 (1998) Characterization of LoxP mutants, including Lox2272
Nat Biotechnol. 21:562 (2003) Development of the FLEX switch system
J Neurosci. 28:7025 (2008) Application of a FLEX switch system
亮点

FLEX Cre-On条件性表达腺病毒载体专为在哺乳动物细胞中实现高效的条件性基因激活表达而设计。目的基因刚开始时为默认不表达,但是在Cre重组酶共表达的情况下将被激活表达,并且将反转和改变目的基因的编码方向。Cre存在的情况下,目的基因的表达受用户自定义的启动子的调控。

该载体由血清型5(Ad5)腺病毒衍生而来。经优化,该载体系统在大肠杆菌体内具有很高的拷贝数,包装的活病毒具有很高的滴度,对大多数宿主细胞具有高效的转导能力,能有效地把载体整合到靶细胞基因组并实现外源基因的高水平表达。

优势

基因激活可控:目的基因ORF的反向放置,可防止基因发生泄漏表达。而某些条件性基因表达系统,如LoxP-Stop-LoxP表达载体系统,在某些情况下可能会有一些低水平的漏表达。

基因稳定激活:在Cre的存在下,LoxP和Lox2272位点对分别重组,导致ORF方向永久性地反转为正向,且其中的一对重组位点将具有相同的方向,Cre会介导产生正向重组切割,继而在ORF的两端留下两个不同的Lox-变体,即使存在Cre也不会进一步发生重组,使得目的基因可以在客户定制的启动子驱动下正常表达。

对宿主基因组造成破坏的低风险性:在转导进入靶细胞后,腺病毒载体在细胞核保持着游离DNA的状态,可以降低宿主基因组被破坏而致癌的风险,使其成为人类体内实验的理想载体。

超高病毒滴度:腺病毒可通过再次转导包装细胞而得到大量扩增,从而获得超高滴度病毒,慢病毒载体、逆转录病毒载体和AAV载体都不具有这个特性。我们提供的腺病毒滴度可以达到>1010 IFU/ml。

载体容量非常大:腺病毒能有效包装的基因组上限大小是~38.7 kb(从5' ITR到3' ITR)。在除去腺病毒包装表达所需主要元件所占用的容量之后,我们的载体具有约~7.5 kb的装载空间以容纳目的DNA(例如启动子,ORF和荧光标记)。相比起容量为6.4 kb的慢病毒表达载体,腺病毒载体容量更大,能满绝大多数应用要求。

宿主范围广泛:来源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳动物细胞都能被腺病毒载体转导,但某些细胞类型则比较难转导(见下文不足之处)。

体内外实验均有效:我们的载体不仅能用于体内活体动物实验,还具有体外细胞转导能力。

安全性高:为了确保腺病毒载体的生物安全性,我们的腺病毒载体缺失了病毒包装所必须的基因(这些基因被整合到包装细胞的基因组)。 所以,利用我们的腺病毒载体包装出来的病毒是复制缺陷型的,并且只有在包装细胞中才具有复制能力。

不足之处

载体DNA非整合型:腺病毒基因组不会整合到靶细胞的基因组中,而是以游离DNA的形式存在,并且随着时间推移逐渐丢失,特别是在分裂细胞中。

难以转导特定类型的细胞:虽然我们的腺病毒载体可以转导很多类型的细胞包括非分裂细胞,但对某些特定类型的细胞如内皮细胞、平滑肌细胞、呼吸上皮分化细胞、外周血细胞、神经元和造血干细胞等,却无法进行有效的转导。

较强的免疫原性:活腺病毒会在动物体内引起强烈的免疫反应,从而限制了其在体内的某些应用。

技术复杂:使用腺病毒载体时,需要在包装细胞中产生活病毒,然后测定病毒滴度。这些过程技术难度更高,周期更长。

载体关键元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

Ψ: Adenovirus packaging signal required for the packaging of viral DNA into virus.

Promoter: The promoter driving your gene of interest is placed here.

Lox2272: Recombination site for Cre recombinase. Mutated Lox site with two base substitutions of wild type LoxP. Incompatible with LoxP sites. When Cre is present, the LoxP and LoxP2272 sites will be cut and recombine with compatible sites.

LoxP: Recombination site for Cre recombinase. Incompatible with Lox2272 sites. When Cre is present, the LoxP and Lox2272 sites will be cut and recombine with compatible sites.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here, in a sense orientation.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

TK pA: Herpes simplex virus thymidine kinase polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

ΔAd5: Portion of Ad5 genome between the two ITRs minus the E1A, E1B and E3 regions.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in medium copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

PacI: PacI restriction site (PacI is a rare cutter that cuts at TTAATTAA). The two PacI restriction sites on the vector can be used to linearize the vector and remove the vector backbone from the viral sequence, which is necessary for efficient packaging.