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VECTOR FAQ

我应该使用哪种荧光蛋白?

近年来已经开发了许多荧光蛋白(FPs),使用哪种荧光蛋白(FP)跟多种因素有关。

单色实验

对于单色实验,绿色荧光蛋白是最常用的。EGFP是最受欢迎的绿色荧光蛋白,是许多单色研究的理想选择。然而,其他绿色荧光蛋白,如TurboGFP(又名maxGFP),对于某些应用可能是一种更好的选择。TurboGFP比EGFP具有更优越的功能,如更明亮的绿色荧光,成熟速度更快,对高pH值和光稳定性耐受更强,这些使其成为早期信号检测和高灵敏度实验的理想选择。如果是红色荧光蛋白,mCherry则由于其单体结构,良好的荧光性质和低毒性等特点使其成为大多数实验的选择,它特别适用于蛋白标记或者当细胞中其他红色荧光蛋白发生细胞毒性或蛋白聚集时。在荧光蛋白发生二聚化和聚集的情况下,dTomato依然可以发出很亮的荧光。DsRed_Express2是另一个红色荧光蛋白的理想选择,它是具有最小细胞毒性的红色荧光蛋白。

多色实验

对于同时使用多个荧光基团的实验(包括荧光蛋白和其他染料如DAPI),研究人员必须仔细考虑荧光基团的光谱性质,以确保激发光和发射光可以在显微镜、流式细胞仪或其他荧光检测设备的滤光片上可以进行观察区分。通常情况下,荧光检测设备应该能够读出每种荧光的荧光信号,而相互不干扰。通过使用激发滤光片来激发目的荧光基团产生合适频率的激发光,使用发射滤片控制目的荧光基团的发射荧光进入荧光检测器。对于两种颜色,标准绿色荧光蛋白如EGFP加上标准红色荧光蛋白如mCherry几乎在所有荧光显微镜和流式细胞仪上都能正常工作。对于三种颜色,蓝色、绿色和红色荧光蛋白组合(如TagBFP + EGFP + mCherry)或青色、黄色和红色组合(例如CyPet + YPet + mCherry)可以很好的一起配合工作,因为这些组合在大多数荧光显微镜或流式细胞仪上易于分辨观察。

荧光共振能量转移(FRET)

荧光蛋白广泛应用于基于荧光共振能量转移(FRET)的实验中。FRET是一种物理过程,在此期间,受激发供体发色基团分子通过非放射性偶极间耦合将能量转移到受体发色基团。FRET会导致供体荧光强度衰减,而受体发射荧光增加。FRET需要一些前提条件:供体和受体必须很接近(10-100Å);受体的吸收光谱必须与供体的发射光谱重叠;供体和受体的跃迁偶极方向必须是平行的。FRET是距离依赖型的,且FRET的效率与供体和受体之间距离的六次方成反比。因此,它对于距离的微小变化非常敏感,使其成为许多研究应用的强大的工具,如研究DNA或蛋白质结构,研究分子间相互作用等。青—黄色供体/受体对CyPet-YPet常用于FRET实验。

我们的建议:

单荧光:EGFP,TurboGFP,mCherry,dTomato或DsRed_Express2(这些荧光蛋白可以跟DAPI一起使用)

双荧光:EGFP + mCherry或TurboGFP + mCherry (这些组合可以跟DAPI一起使用)

三荧光:TagBFP + EGFP + mCherry或CyPet + YPet + mCherry (如果使用合适的滤片,第二种组合可以跟DAPI一起使用)

FRET-based应用:CyPet - YPet

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