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常见问题

我应该选择单gRNA还是双gRNA用于CRISPR介导的基因敲除?

对于CRISPR介导的基因组编辑,Cas9核酸酶靶向位点特异性引导RNA(gRNA)的靶位点以产生DNA切割。在大多数情况下,为了产生简单的基因敲除,可以将单个gRNA与Cas9一起使用以产生双链断裂(DSB),并通过非同源末端连接(NHEJ)低效修复,导致永久突变 ,如在修复位点产生小插入或缺失。某些突变会产生移码,终止密码子提前出现等,从而导致目的基因功能缺失。如果基因组中两个临近的位点(如小于几kb)同时作为靶向位点,使用双gRNA可能会导致中间区域片段的缺失(即片段敲除)。

如果使用Cas9_D10A缺刻酶靶向单个靶位点的两条相对链,则可以使用双gRNA。缺刻酶将在两条链上产生单链切割,两条gRNA分别引导缺刻酶在对应的一条链上进行切割,从而引起靶位点处发生DSB。 通常情况下,这种方法可以减少CRISPR/Cas9的脱靶效应,因为需要两个gRNA同时打靶才能产生DSB。

当使用Cas9_D10A缺刻酶和外源Donor DNA模板将特定碱基(例如敲入)引入目的基因时,也可以使用双gRNA。两个gRNA靶向位于所需突变位点侧翼的两条相对链,然后通过同源定向修复(HDR)的方法利用外源模板来修复被切除的序列。

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