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常见问题

相比CRISPR和TALEN基因敲除技术,shRNA介导的RNA干扰有什么优缺点?

shRNA干扰或者核酸酶介导的基因敲除(如CRISPR、TALEN)都是在细胞水平上,研究基因缺失对功能影响的重要实验方法。为了确定哪一种方法对您的应用是最优选择,需要考虑以下几个方面。

作用机制
  • 干扰载体

    干扰载体通过表达短发夹RNA(shRNAs)来诱导细胞内目标mRNA的切割,抑制其翻译,从而达到在细胞水平抑制靶mRNA的功能。因此,shRNA干扰载体不会引起靶基因DNA序列的变化。

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  • 基因敲除载体

    CPISPR和TALEN都是通过引导核酸酶切割基因组的特定靶位点来起作用,切口被细胞机制低效修复,导致永久性突变,如在修复位点插入或者缺失几个碱基。某些突变会产生移码,终止密码子提前出现等,从而导致目的基因功能缺失。如果基因组中两个临近的位点(如小于几kb)同时作为靶向位点,可能会导致中间区域片段的缺失(即片段敲除)。

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靶向效率

shRNA介导的干扰不会完全抑制靶基因的表达,即使是最有效的shRNAs。相比之下,CRISPR和TALEN可以在某些细胞产生永久的突变从而导致基因功能的完全丧失。

一致性和均一性

在不同的转染细胞间,shRNA干扰载体能够产生较高的均一性和一致性。相反,CRISPR和TALEN技术由于插入突变的随机性,细胞之间是高度不均一的。为了完全敲除靶基因,该基因的所有拷贝都必须被敲除。假设正常细胞的基因都具有两个拷贝(除了X-或Y-连锁基因),而癌细胞可以有多个拷贝,这种完全敲除细胞的占比是非常少的。因此,核酸酶介导的敲除需要通过测序筛选以确认靶基因的所有拷贝已经被敲除。

脱靶效应

shRNA介导的干扰与核酸酶介导的基因敲除都具有脱靶效应。脱靶表型可以通过使用多种不同的shRNA靶向相同的目的基因来验证。如果同一个基因使用多个不同的shRNA干扰导致表型变化一致,那么说明表型改变不是由脱靶效应引起。而对于CRISPR或TALEN基因敲除,应当分析多个含有功能缺失突变的克隆,以排除由于脱靶效应导致的表型改变。此外,可以对生物信息学预测的脱靶位点进行测序以确认是否发生突变

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