Probe-RNA体外转录载体(用于原位杂交)

概述

我们的体外转录载体是简单有效的RNA转录系统,适用于各种研究。长RNA体外转录载体可用于产生RNA探针(即核糖核酸探针),用于原位杂交。

该系统结合了T7和SP6启动子,您的目的序列将被克隆在这两个启动子之间。在适当的反应条件和三磷酸核苷酸的存在下,T7噬菌体RNA聚合酶(T7 RNAP)或SP6 RNAP可以促进高效合成核糖核酸探针。这两个启动子方向相反,一个启动子将产生“有义”转录物,另一个将产生“反义”转录物。根据插入片段的方向和实验目的,用户可以选择使用T7 RNAP、SP6 RNAP或两者一起进行体外转录。T7和SP6启动子侧翼序列也可用作PCR扩增或测序的引物结合位点。通过利用半抗原标记的或荧光基团标记的或是放射性标记的核苷酸进行转录,以便于原位杂交探针定位检测。我们建议您参考已发表文献中经测试的体外转录和原位杂交步骤说明来进行实验。

T7和SP6 RNAP对于有效的转录起始均具有碱基要求,且这些碱基已经被放置到载体上。T7启动子3'末端的前两个碱基是GG,紧接着是客户的目的序列;SP6启动子3'末端的前三个碱基是GAA,紧接着是客户的目的序列。

我们的长RNA体外转录载体会发生失控转录,这意味着T7和SP6 RNAP的转录能进行到DNA模板的末端,不会在质粒内的任何特定位点终止。因此,在体外转录之前,应单酶切线性化环状质粒。在T7启动子上游含有BsiWI、AgeI和AscI单酶切位点;在SP6启动子的上游含有vrII,XhoI,NotI和SapI单酶切位点,这些酶切位点均可以在目的序列的下游进行单酶切。值得注意的是,待转录的序列不能含有所用线性化酶切位点,以免产生截短的mRNA。不纯的酶切产物可能会抑制随后的转录反应,因此建议通过柱子或酚氯仿来纯化酶切产物。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Nucleic Acids Res. 7:1931 (1979) Cloning and characterization of the T7 promoter
Nucleic Acids Res. 21:5480 (1993) Characterization of the SP6 promoter
Methods. 52:322 (2010) Methods for generating RNA probes by in vitro transcription, and their use for in situ hybridization.
亮点

我们的长RNA体外转录载体能高效用于T7或SP6 RNAP介导的体外转录。该载体在大肠杆菌中具有高拷贝复制能力,易于酶切,有助于大量生成mRNA。

优势

效率高:T7和SP6  RNAP是高效酶,其介导的体外转录可大量产生功能性RNA。

技术简单:与其他探针合成方法相比,使用质粒模板进行体外转录,操作更方便。

双向性:该载体系统含有两个体外转录启动子,以相反方向分别在目的序列的两侧。 客户可以根据目的序列的方向,选择T7或SP6启动子来合成有义或反义核糖核酸探针。

不足之处

失控转录:为了产生正确有效的转录产物,在进行转录反应之前需要通过限制性内切酶线性化质粒模板。

载体关键元件

T7 promoter: A promoter for the RNA polymerase from T7 bacteriophage. Drives high-level transcription of the downstream sequence of interest. This promoter is in the opposite orientation to the SP6 promoter, and will generate a transcript which is the reverse-complement of that produced from the SP6 promoter using the same template.

Transcribed sequence: Your DNA sequence of interest to be transcribed into RNA is placed here.

SP6 promoter: A promoter for the RNA polymerase from SP6 bacteriophage. Drives high-level transcription of the downstream sequence of interest. This promoter is in the opposite orientation to the T7 promoter, and will generate a transcript which is the reverse-complement of that produced from the T7 promoter using the same template.

BsiWI, AgeI, AscI, AvrII, XhoI, NotI, SapI: Unique restriction endonuclease sites that can be used to linearize the plasmid prior to in vitro transcription.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.