随着合成生物学与基因工程技术的快速发展，细菌基因组编辑正逐渐成为解决关键科研难题的重要工具。为满足不同研究场景中对多种细菌高效、精准改造的需求，云舟生物重磅推出“细菌基因组编辑服务”！该服务整合了λ Red同源重组、CRISPR/Cas9和自杀质粒等主流编辑策略，结合我们在基因敲除、插入以及靶向突变等方面的深厚技术积累，提供覆盖面广、效率高的全方位细菌基因组编辑解决方案。

细菌基因组编辑是指通过人工手段对细菌的DNA序列进行精确修改，包括插入、删除、替换或调控基因。这项技术的核心在于利用特定工具精准定位目标基因，并进行精细编辑，从而实现对细菌生理或代谢特性的精确修饰与调控。细菌基因组编辑技术在抗生素研发、疫苗开发、细菌代谢工程、环保、农业等领域展现出广阔的应用潜力。

一、基于λ Red的同源重组方法

同源重组技术是一种历史悠久且传统的基因编辑方法，它借助细菌固有的同源重组机制，在人工干预下实现异源基因的插入或删除。λ Red重组系统是细菌基因组编辑领域广泛采用的工具之一。这一系统源自λ噬菌体，能够显著提升外源DNA片段与宿主基因组之间的同源重组效率。该系统由三个核心组件构成：

Exo：一种5'至3’方向的核酸外切酶，负责切割双链DNA（dsDNA）；

Beta：一种单链DNA（ssDNA）结合蛋白，有助于外源DNA片段与目标位点的同源序列进行退火配对；

Gam：一种抑制宿主细胞核酸酶的蛋白，能够防止导入细菌细胞的外源DNA被降解。

正是这三个组分的协同作用，促进了外源DNA片段与细菌基因组的整合。 

图1 基于λ Red的同源重组

λ Red基因通常在引入供体DNA之前就需要在细菌细胞中表达。一种表达方法是使用编码该组分的质粒，或者采用稳定整合了λ Red基因的细菌菌株，这些菌株常用于基因组编辑。含有遗传修饰的供体DNA可以以线性双链DNA（dsDNA）或单链DNA（ssDNA）的形式导入细菌细胞，而该供体序列模板通常含有筛选标记（如抗生素抗性基因）。重组完成后，通常采用药物筛选结合菌落PCR的方法来分离获得成功编辑的细菌细胞。

二、基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术

CRISPR/Cas9是一种广泛应用于各类生物（包括细菌）的基因组编辑工具。在许多细菌物种（如大肠杆菌）中，由于非同源末端连接（NHEJ）修复途径的效率低下，CRISPR诱导的双链断裂（DSB）将具有致死性。这一特性使得CRISPR无需额外筛选标记即可实现强效的反向筛选。

图2 CRISPR基因编辑在细菌中创建点突变

基于CRISPR系统的细菌基因组编辑所需组分通常包括Cas9蛋白、向导RNA（gRNA）以及供体DNA。为了提高编辑效率，通常会共表达重组酶（如λ-Red系统的组分）以促进同源重组的发生。

CRISPR组件的基因递送可以通过多种策略实现。一个典型的方法是将Cas9与λ Red重组系统的蛋白使用单个质粒共表达，而gRNA则使用第二个质粒进行表达。采用这种方法进行基因组编辑时，编码Cas9和重组酶的质粒首先被导入细菌细胞，然后诱导λ Red蛋白的表达。接着，将表达gRNA的质粒以及供体DNA导入已表达Cas9和重组酶的细胞。

如果同源重组失败，则由Cas9引发的DSB将导致细胞死亡。相对地，只有当细胞成功发生了供体DNA和基因组靶序列之间的同源重组时，细胞才能存活，从而实现所需的基因修饰。

三、使用自杀质粒导入序列

自杀质粒携带着用于基因编辑的同源序列，并被设计为仅在特定宿主或条件下复制。这一特性通常通过以下机制实现：利用反向筛选标记（例如赋予蔗糖敏感性的sacB基因）以及条件性复制系统（如温度敏感型复制起点）。

图3 使用包含温度敏感型复制起点的自杀质粒进行基因敲入

在适宜条件下，将质粒引入目标细菌后，通过一次同源重组事件，质粒即可整合进宿主基因组。当环境转变为非适宜条件时，未整合的质粒因无法复制而丢失。随后发生的第二次同源重组事件将质粒骨架序列从基因组中移除，此时可通过PCR筛选得到携带所需编辑的细胞。

值得注意的是，尽管该技术原理简单，但自杀质粒需要较长的同源臂，且存在较高的假阳性风险，因此通常需要进行多轮筛选。不同的细菌基因组编辑方法之间有着不同的优缺点，通常需要结合多种方法，才能实现理想的编辑效果：

依托在载体构建与基因组编辑领域的长期积累，云舟生物提供涵盖策略设计至菌株交付的全流程细菌基因组编辑服务。目前服务已全面上线，欢迎联系我们了解详细方案，一起加速科研突破，探索更多未知。

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