产品特点

CRISPRi慢病毒
  • CRISPRi(CRISPR interference)慢病毒套装包含2种病毒:gRNA慢病毒和dCas9-Silencer2慢病毒。1个gRNA慢病毒同时携带gRNA表达盒子和Puromycin抗性基因。1个dCas9-Silencer2慢病毒同时携带dCas9-Silencer2表达盒子和Hygromycin抗性基因。病毒感染细胞后,病毒基因组整合到细胞基因组中,随细胞分裂而复制,实现外源基因长期稳定表达。gRNA和dCas9-Silencer2融合蛋白需同时存在,CRISPRi才能工作。使用Puromycin和Hygromycin两种抗生素筛选出成功感染2种病毒的细胞进行下游实验。
  • dCas9(dead Cas9)是Cas9的突变体,缺失了核酸内切酶的能力。一旦表达,dCas9蛋白和gRNA将形成一个核糖核蛋白复合物(Ribonucleoprotein complex)。dCas9-gRNA复合体将任意地结合细胞基因组上的PAM序列(SpCas9的PAM序列为5'-NGG-3'),但只有gRNA分子的5‘引导序列(Guide sequence,约20 bp)与细胞基因组DNA配对时,dCas9才会充分解开靶序列的上下链,gRNA进一步与靶序列的其中一条链完全互补结合,此时,dCas9-gRNA复合体稳定地结合到靶序列上。CRISPRi系统中,一般将gRNA设计为靶向一个基因的TSS(transcription start site)位置(-50到+300区域为佳)。在此位置,dCas9-gRNA复合体本身就能物理性地阻碍RNA聚合酶的作用,从而影响基因的表达。dCas9-Silencer2是一个dCas9融合了KRAB等转录抑制子的融合蛋白。KRAB等转录抑制子能进一步抑制基因的表达。Silencer2版本的转录抑制子,在KRAB的基础上进行了优化,抑制效率更高。
  • 多条gRNA作用一个基因的TSS区域,抑制效果更佳。

与shRNA相比,CRISPRi基因抑制更特异

shRNA CRISPRi
工作原理 基因敲除能通过short hairpin RNAs(shRNAs)实现。shRNA表达后,被加⼯成small interfering RNAs(siRNAs)。这些siRNA被运到RNA-induced silencing complex(RISC)那里。接着,siRNA的反向链与正向链解开,正向链被降解、丢弃,反向链继续与RISC复合物结合,将有活性的RISC复合物引导⾄与反向链互补的mRNA。⼀旦反向链与mRNA完全互补结合,RISC复合物中的⼀个蛋白,argonaute,会剪切mRNA,从而抑制mRNA编码的蛋⽩翻译表达。 CRISPR interference(CRISPRi)技术采⽤了⼀个nuclease-dead Cas9蛋白(dCas9)与转录抑制因⼦组成的融合蛋白,例如Kruppel-associated box(KRAB)转录抑制因子。在这个融合蛋白里,dCas9仍然保留与DNA结合的活性,但是失去了核酸酶活性。dCas9融合蛋⽩在⼀条guide RNA(gRNA)引导下,结合至目标基因的transcriptional start site(TSS)区域,从而阻遏该基因的转录。
目标分子 成熟mRNA 基因的TSS区域
打靶事件发⽣位置 细胞质 细胞核
抑制基因种类 mRNA编码基因、胞质lncRNA mRNA编码基因(针对因转录本太短而不能设计出有效shRNA的基因,可选择CRISPRi技术)、胞质lncRNA、核内lncRNA
脱靶⻛险

RNAi存在2类脱靶:序列相关性和非序列相关性

序列相关性脱靶:
仅凭有限的部分碱基互补,siRNA就能引起非目标mRNA的沉默。
取决于siRNA序列,⼀个siRNA可能抑制成百上千条转录本。

非序列相关性脱靶:
shRNA采⽤内源miRNA通路实现基因敲除。当⼤量shRNA导⼊细胞后,它们使RNAi系统达到饱和,并与内源miRNA竞争蛋白,例如Dicer、RISC和其它因子。由此,那些内源miRNA介导的基因调控受到干扰,导致不可以预期的脱靶。

与shRNA相比,CRISPRi的脱靶机率超低。
可逆的基因抑制 如使⽤质粒载体或者合成的siRNA,基因沉默是可逆的。如使⽤整合型病毒载体(如:慢病毒载体)实现结构性表达shRNA,则沉默非可逆性。 如使⽤质粒载体或者合成的dCas9融合蛋白/gRNA,基因沉默是可逆的。如使⽤整合型病毒载体(如:慢病毒载体)实现结构性表达dCas9融合蛋白和gRNA,则沉默非可逆性。如沉默重要的基因,推荐使⽤TetOn诱导表达CRISPRi慢病毒载体,可通过药物控制这些基因的沉默。

产品规格

产品/服务 规格 交付内容 货号 价格(¥)
CRISPRi慢病毒载体3件装 - 3个定制gRNA慢病毒载体 3Ecoli(LVgRNAi) ¥1,780
CRISPRi慢病毒3+1套装 小规格包装

3个定制gRNA慢病毒,每个定制病毒:>108 TU/ml,10x 25 ul
1个dCas9-Silencer2辅助慢病毒:>108 TU/ml,3x 100 ul

3LVS(LVgRNAi)-H ¥5,400
中规格包装

3个定制gRNA慢病毒,每个定制病毒:>108 TU/ml,10x 100 ul
1个dCas9-Silencer2辅助慢病毒:>108 TU/ml,10x 100 ul

3LVM(LVgRNAi)-H ¥7,700
中规格包装和超纯化

3个超纯化定制gRNA慢病毒,每个定制病毒:>109 TU/ml,10x 50 ul
1个超纯化dCas9-Silencer2辅助慢病毒:>109 TU/ml,10 x 50 ul

3LVMP(LVgRNAi)-H ¥15,400
大规格包装和超纯化

3个超纯化定制gRNA慢病毒,每个定制病毒:>109 TU/ml,10x 100 ul
1个超纯化dCas9-Silencer2辅助慢病毒:>109 TU/ml,10 x 100 ul

3LVLP(LVgRNAi)-H ¥19,300
Puromycin抗生素溶液 - 10 mg/ml,200 ul,溶于HEPES缓冲液,无菌 C002S ¥200
Hygromycin抗生素溶液 - 100 mg/ml,200 ul,溶于HEPES缓冲液,无菌 C003S ¥200

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