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## 概述
CRISPR/Cas9（成簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9）系统极大地促进了多种物种的体外和体内基因抑制实验。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22
nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特异性。gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。Cas9扫描基因组并切割与gRNA互补的序列，前提是这些序列跟随着一段NGG前间区序列邻近基序（PAM）。双链DNA断裂随后被HDR或者NHEJ途径修复，从而产生不同大小长度的位点突变（碱基插入或缺失）。
使用一个一体化的同时表达Cas9和gRNA的载体，或者分开表达Cas9和gRNA的载体，可以方便地在线虫中进行CRISPR/Cas9编辑。该载体系统属于前者，一个载体上同时表达gRNA和一个线虫密码子优化的Cas9（CeCas9）。该载体可以被注射到线虫的远端性腺，然后进入生殖细胞细胞核。筛选突变后代，获得突变可遗传的基因敲除线虫品系。
为了实现在线虫中的高效CRISPR基因编辑，云舟生物开发了gRNA和Cas9共表达载体。...
## 概述
我们的腺相关病毒（adeno-associated
virus，简称AAV）shRNA干扰载体系统是一种非常高效的能稳定在体内和体外干扰各种哺乳动物细胞靶基因表达的载体工具。AAV的免疫原性极低，在体内几乎没有致病性，使得AAV成为许多动物研究的理想工具。
AAV重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中，位于两个反向重复序列（ITRs）之间的DNA片段与辅助质粒表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。当病毒转导宿主细胞时，两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞，线性双链DNA基因组以游离DNA的形式存在于细胞核中。由人类U6启动子驱动表达的shRNA将会导致靶基因mRNA的降解。
在大多数情况下，可以在生物安全1级（BSL1）设施中处理AAV。AAV是复制缺陷型的、不会引起炎症反应和引发人类疾病。
人们已从自然界中鉴定出许多AAV病毒株，根据病毒表面衣壳蛋白的不同抗原将它们分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的组织亲和性（即感染组织特异性）。当我们的AAV载体使用不同的衣壳蛋白包装病毒时，则会赋予病毒不同的血清型。...
该系统利用目的序列上游的T7启动子，通过T7噬菌体RNA聚合酶（T7
RNAP）和三磷酸核苷酸，在适当的反应条件下高效生成小RNA。我们建议您参考已发表文献中经测试的体外转录步骤说明来进行体外转录。
T7 RNAP对于有效的转录起始具有碱基要求，且这些碱基已经被放置到载体上。T7启动子3'末端的前两个碱基是GG，紧接着是客户的目的序列。
我们的小RNA体外转录载体会发生失控转录，这意味着T7
RNAP的转录能进行到DNA模板的末端，不会在质粒内的任何特定位点终止。因此，在体外转录之前，应通过使用SapI来单酶切线性化环状质粒。SapI单酶切位点正好位于目的序列的下游。值得注意的是，待转录的序列不能含有所用线性化酶切位点，以免产生截短的mRNA。不纯的酶切产物可能会抑制随后的转录反应，因此建议通过柱子或酚氯仿来纯化酶切产物。
在体内应用中，许多RNA都会进行5'末端的修饰，称为5'加帽。对于不同的实验目的，未加帽的体外转录小RNA通常能产生良好的实验效果。请根据您的实验性质来决定RNA是否需要加帽。
如果需要，则可以通过使用帽子类似物共转录或使用加帽酶转录后修饰获得加帽RNA。...
Tet-
On诱导型基因表达载体作用：当不存在四环素及其类似物（如doxycycline）的情况下，目的基因几乎或完全沉默；当往体系中添加四环素或其他类似物（如doxycycline）时，目的基因得到快速高水平表达。
这是通过多组分系统实现的，即四环素不存在的情况下，tTS蛋白使得基因沉默；四环素存在的情况下，rtTA蛋白使得基因正常表达。
在生物医学领域，利用常规转染将质粒载体转到哺乳动物细胞中是使用最广泛的方法。虽然近年来开发了不少更为先进的基因导入载体系统（如慢病毒载体、腺病毒载体、AAV载体和PB转座子载体等），但常规质粒基因表达载体仍被大多数实验室使用，这主要得益于其在技术上的简便性以及在各种类型细胞中的高效转染率。常规质粒载体转染的关键特点是短暂性，并且在宿主基因组中的整合效率非常低（通常小于1%）。
关于该载体系统的更多信息，请参考以下文献。
参考文献 | 主题
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Science 268:1766-1769 (1995) | Development of rtTA....
## 概述
腺相关病毒（AAV）载体系统是一种备受欢迎的体内外基因传递系统，对哺乳动物多种类型细胞具有高效的转导效率。不同于腺病毒，AAV的免疫原性极低，在体内几乎没有致病性，使得AAV成为许多动物研究的理想工具。
AAV重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中，位于两个反向重复序列（ITRs）之间的DNA片段与辅助质粒表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。
当病毒转导宿主细胞时，两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞，线性双链DNA基因组以游离DNA的形式存在于细胞核中。
在大多数情况下，可以在生物安全1级（BSL1）设施中处理AAV。AAV是复制缺陷型的、不会引起炎症反应和引发人类疾病。
人们已从自然界中鉴定出许多AAV病毒株，根据病毒表面衣壳蛋白的不同抗原将它们分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的组织嗜性（即感染组织特异性）。当我们的AAV载体使用不同的衣壳蛋白包装病毒时，则会赋予病毒不同的血清型。AAV包装时的ITR序列来源于AAV2，这是一种常用的AAV载体构建方式，不影响血清型。...
## 概述
腺病毒shRNA干扰载体系统是一种可在多种哺乳动物细胞中稳定干扰靶基因表达的高效方法。该载体不会整合到宿主细胞的基因组中，而是以游离DNA形式存在。该系统是体内应用测试的优先使用方法。
腺病毒载体来源于诱发普通感冒的腺病毒，野生型腺病毒基因组是线性双链DNA。
腺病毒重组载体构建完成后转染进入包装细胞。在包装过程中，位于两个反向重复序列（ITRs）之间的DNA片段与由包装细胞表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。
当病毒转导宿主细胞时，两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞，并以游离DNA的形式存在于细胞核中。由人类U6启动子驱动表达的shRNA将会导致靶基因mRNA的降解。
通过改造优化，我们的腺病毒载体缺失了E1A、E1B和E3区，前两者与病毒包装相关（这两个基因已被整合到包装细胞的基因组中）。因此，运用我们的病毒载体包装出来的病毒是复制缺陷型的（只能转导靶细胞而不能自我复制），大大提高了生物安全性。
关于该载体系统的更多信息，请参考以下文献。...
在包装过程中，位于两个反向重复序列（ITRs）之间的DNA片段与由包装细胞表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。
当病毒转导宿主细胞时，两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞，并以游离DNA的形式存在于细胞核中。
通过改造优化，我们的腺病毒载体缺失了E1A、E1B和E3区，前两者与病毒包装相关（这两个基因已被整合到包装细胞的基因组中）。因此，运用我们的病毒载体包装出来的病毒是复制缺陷型的（只能转导靶细胞而不能自我复制），大大提高了生物安全性。
关于腺病毒基因表达载体的更多信息，请参考以下文献。...
## 概述
杆状病毒载体系统广泛应用于昆虫细胞中表达重组蛋白，它是真核表达重组蛋白最通用和最强大的系统之一。该系统特别有利于在真核宿主细胞中大规模制备重组蛋白。许多真核生物蛋白的翻译后修饰只能在真核细胞中发生（例如糖基化），或者需要真核细胞环境来进行正确折叠（例如膜蛋白质），而原核蛋白表达系统却没有这些功能。
杆状病毒是一种双链DNA病毒，通常会感染昆虫，特别是鳞翅目昆虫（moths, butterflies and
skippers）。我们的克隆载体pBV是经优化的，可与来自AcMNPV（Autographa californica multicapsid
nucleopolyhedrovirus）的穿梭载体（称为Bacmid）一起使用，该穿梭载体的野生型基因组大小为134 kb。
首先将目的基因克隆到含有强启动子的pBV载体上，目的基因表达盒与庆大霉素抗性基因的侧翼序列为Tn7转座子末端元件Tn7L和Tn7R。然后，将该载体转化到携带Bacmid穿梭载体和辅助质粒的大肠杆菌中。...
## 概述
对模式生物秀丽隐杆线虫（C.
elegans）而言，在其基因组特定位点引入单拷贝外源基因是一种常见的研究模式。ttTi5605基因座表达载体是一种经过良好验证的可用于线虫的特定位点的外源基因单拷贝插入的高效系统。该系统使用Mos1转座子剪切机制或CRISPR机制向线虫引入稳定整合的外源基因插入。
Mos1转座子首先在果蝇（Drosophila
mauritiana）中被发现。当前，相当一部分的线虫种属已经被开发出包含确定的Mos1转座子插入位点。一个例子是基因组ttTi5605区域包含了Mos1位点的线虫种属。使用ttTi5605基因座的原因在于在该区域插入序列不会扰乱临近基因的功能。此外，Mos1转座子剪切技术可以将外源基因以单拷贝的方式插入基因组，不容易被线虫自身的RNAi系统沉默（重复元件序列通常易被细胞转录抑制）。Mos1介导的ttTi5605位点的基因特异性重组需要ttTi5605基因座表达载体与一个表达转座酶的辅助质粒共转染线虫。通过热激法可以激活转座酶活性，从而导致Mos1转座子在线虫基因组发生剪切。...
## 概述
我们的Tol2载体系统可以非常有效地将外源DNA插入到宿主细胞的基因组中。该系统技术简单，利用质粒转染或电转的方法可将您感兴趣的基因永久整合到宿主基因组中。
该系统来源于Tol2转座子，它最初是从硬骨鱼青鳉鱼（Oryzias latipes）中分离出来的。
基于序列同源性分析，发现Tol2转座子与整个脊椎动物基因组中发现的非自主元件的hAT家族密切相关。
Tol2系统包含两个载体，一个载体被称为辅助质粒，负责编码转座酶；另一个载体被称为转座子质粒，包含两个反向末端重复序列（ITRs）以及两者之间的转座区域，需要被转座到宿主基因组中的目的基因就克隆在这个区域。
当辅助质粒和转座子质粒共转染靶细胞时，辅助质粒产生的转座酶将会识别转座子的两个ITR，然后将被转座区和两个ITR元件插入到宿主基因组中。Tol2转座子在宿主细胞中的插入位点没有明显碱基偏好性，这不同于具有特定靶标位点的转座子系统。如，PB转座插入通常发生在包含TTAA序列的宿主染色体位点。...
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