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## 概述
pET载体系统是用于在大肠杆菌中表达重组蛋白的功能强大且广泛使用的系统，载体上的噬菌体T7强启动子能够调控目的基因的转录和翻译。细胞内存在T7
RNA聚合酶时，重组蛋白的表达被激活。当处于完全诱导状态时，几乎所有细胞资源都会致力于表达目的蛋白，仅需几个小时的诱导，目的蛋白的表达量就可以占细胞总蛋白的一半。
关于该载体系统的更多信息，请参考以下文献。
参考文献 | 主题
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Methods Enzymol. 185:60-89 (1990) | Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.
J Mol Biol. 219:45 (1991) | Development of the T7lac promoter system.
## 亮点
首先，在缺乏T7
RNA聚合酶基因的宿主菌中，将目的基因克隆到pET载体上，这样可以以防止重组毒性蛋白的表达引起的质粒不稳定性。...
## 概述
我们的毕赤酵母重组蛋白表达载体系统有着非常强大高效的重组蛋白表达能力。毕赤酵母作为一种甲基营养型酵母，被广泛应用在蛋白产品的研究和工业应用上。
在该载体系统中，目的基因通常被克隆在甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子（GAP）和乙醇氧化酶1启动子（AOX1）的下游，这取决于基因的基本结构和表达诱导条件的要求。GAP是一个强大的组成型启动子，而AOX1则是受甲醇严格高效调控的启动子，这两个启动子都能够介导目的基因的高水平表达，目的蛋白的累加总量往往可达总细胞可溶性蛋白的30%以上。一般来说，GAP启动子的表达能力略强于诱导状态下的AOX1启动子。我们建议您做一个时间曲线测试，以确定表达目的蛋白的最佳启动子类型。
与酿酒酵母不同的是，毕赤酵母以甲醇为基础碳源，能更高水平地介导重组蛋白的表达（通常是酿酒酵母的的10-100倍）。另外，毕赤酵母和酿酒酵母在技术上有许多共通之处（如互补作用），通用的基因注释和遗传命名法简化了两个物种的研究。
关于该载体系统的更多信息，请参考以下文献。...
## 概述
pBAD载体系统是用于在细菌中表达重组蛋白的可靠且可控的系统，该系统通过araBAD操纵子控制大肠杆菌L-
阿拉伯糖的代谢。将目的基因置于pBAD载体中araBAD启动子的下游，当L-
阿拉伯糖存在时，araBAD启动子驱动目的基因的高效表达；当葡萄糖存在时，目的基因的表达则被抑制。该载体系统可精确控制目的基因的表达，特别适用于生产困难蛋白，如具有毒性或不溶性蛋白。
关于该载体系统的更多信息，请参考以下文献。
参考文献 | 主题
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J Bacteriol. 177:4121-30 (1995) | Development of pBAD vectors
## 亮点
首先，将目的基因克隆到pBAD载体上，并将携带该质粒的菌株在缺乏L-阿拉伯糖的生长培养基中培养以降低质粒不稳定性。然后，通过向培养基中加入L-
阿拉伯糖来诱导目的基因的表达。
我们的pBAD载体上携带的双向araBAD启动子可同时驱动目的基因和调节蛋白AraC的表达。在缺少L-
阿拉伯糖的情况下，AraC在启动子区域二聚化形成环阻断转录。...
## 概述
pCS载体系统是用于在大肠杆菌中低温（通常15℃）高效表达重组蛋白的系统。该载体系统基于大肠杆菌冷休克基因cspA和部分lac操纵子，是pET和pBAD系统（两者是在37℃表达）的补充。
温度与重组蛋白质的折叠有关，从而影响蛋白的溶解度和稳定性。因此，许多在37℃下溶解度和稳定性较差的蛋白，能在较低温度下有所改善。当重组蛋白37°C诱导表达的pET或pBAD载体系统中表达困难时，pCS系统可能是一种非常有用的替代方法。
将目的基因置于pCS载体中cspA启动子、lac操纵子（LacO）和cspA的5'UTR和短翻译增强元件（TEE）的下游。
由于在37℃下5'UTR非常不稳定，cspA启动子在此温度下的转录非常低效。但当将宿主菌转移至15℃时，5'UTR会形成高度稳定的二级结构。TEE序列可以通过核糖体的捕获来增强目的基因的翻译起始。
该质粒还携带有LacI天然启动子和编码序列，LacI蛋白作用于邻近cspA启动子的LacO序列以阻断目的基因的转录。在不存在IPTG的情况下，这种抑制作用可以阻止下游基因的泄漏表达，而加入IPTG则会阻断LacI的抑制作用。...
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## 试验验证
Figure 1. EGFP expression in yeast using VectorBuilder's yeast episomal
plasmid (YEp) gene expression vector. (A) An episomal vector expressing a
codon-optimized EGFP gene driven by a GPD promoter is transformed into a
uracil auxotrophic S. cerevisiae strain....
在基因治疗的临床前和临床阶段的研究中，可通过Baculovirus-
AAV嵌合病毒载体高效且大规模生产重组AAV以符合剂量和安全性要求。
利用杆状病毒（Baculovirus）生产重组AAV需要将两种杆状病毒共转导昆虫Sf9细胞。第一种杆状病毒表达位于两个AAV
ITR元件之间的目的基因，第二个杆状病毒表达AAV
rep和cap基因。为制备两种杆状病毒，每种杆状病毒的表达框均被克隆至一个杆状病毒转移质粒。该质粒的整个表达框与庆大霉素（Gentamycin）抗性基因位于质粒上的两个Tn7转座子末端序列之间（Tn7L和Tn7R）。该质粒被转化至带有杆粒（Bacmid）和辅助载体的大肠杆菌。杆粒可以被看作一个特别巨大的质粒，包含了修饰过后的杆状病毒基因组序列。该序列上带有lacZ基因以及位于该基因内部的attTn7位点。因此转移质粒上两个Tn7之间的序列通过Tn7转座酶与杆粒重组后将插入lacZ基因，随后通过庆大霉素抗性筛选和蓝白筛选即可获得重组成功的大肠杆菌。从大肠杆菌提取的杆粒纯化后用于转染昆虫Sf9细胞。...
## 概述
我们的pUASTattB载体系统是一个高效的转基因果蝇制备和基因表达控制系统。该系统利用噬菌体φC31整合酶介导的重组实现靶向基因有效插入，并结合强大的诱导型启动子Gal4调节转基因表达。pUASTattB载体系统类似于pUAST系统，然而它是利用φC31整合酶介导重组而不是基于P元件的转座实现目的基因的插入。
噬菌体φC31整合酶能高效介导噬菌体附着位点（称为attP）和细菌附着位点（称为attB）之间的序列特异性重组。与基于转座子系统（如P元件介导的重组）相反，φC31介导的插入是不可逆的。pUASTattB整合到attP位点后会产生两个新的位点（attL和attR），新的位点将不再被φC31整合酶识别。另外，基于φC31的插入是具有位点特异性的，通常仅在attP位点发生。基于这个原因，pUASTattB载体系统通常用于携带attP"着陆位点"的果蝇系。
pUASTattB系统包含两个载体，一个称为pUASTattB载体或是携带attB位点和目的基因的φC31供体载体；另一个为编码φC31整合酶的辅助载体。...
## 概述
我们的pUASTB载体系统是一个高效的转基因果蝇制备和基因表达控制系统。该系统能够利用果蝇P元件转座子系统（如pUAST）或噬菌体φC31整合系统（如pUASTattB）并结合强诱导型启动子Gal4调节转基因的表达。因此，pUASTB载体系统可用于P转座子和φC31整合酶介导目的基因插入。目的基因会被克隆到pUASTB两个P-
元件末端重复序列中间和attB重组位点附近的区域。
为了实现P转座子介导的插入，将pUASTB质粒和表达P转座酶的辅助质粒共同导入宿主细胞或胚胎中。
接着，由辅助质粒产生的转座酶识别pUASTB质粒上的两个P元件末端重复序列，并将包含两个P元件末端重复之间的序列插入宿主基因组中。
为了实现φC31整合酶介导的插入，将pUASTB质粒和表达φC31整合酶的辅助质粒共同导入宿主细胞或含有attP位点的胚胎中。φC31整合酶介导attB和attP位点之间的不可逆重组，导致pUASTB载体线性化并整合到宿主基因组中。
mini white基因的表达，可以使果蝇的眼色发生变化，是鉴定转基因果蝇成功与否的标记。...
## 概述
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR Associated
Protein
9（CRISPR/Cas9）系统是近年新兴的基因编辑工具之一，另外两种是ZFN和TALEN。由于CRISPR/Cas9的构建更简易，超越了更早开发的ZFN和TALEN技术，成为现今基因编辑领域最炙手可热的技术。CRISPR/Cas9技术源于原核免疫系统CRISPR/Cas。在自然界中，细菌利用CRISPR/Cas抵抗质粒和噬菌体等外源遗传物质的入侵，从而保持自身基因组的完整性。
两个生物大分子，Cas9蛋白和gRNA（guide
RNA）组成了CRISPR/Cas9基因编辑系统。在细胞内，Cas9蛋白与gRNA形成复合物，能特异性鉴别出靶序列。此过程中，Cas9蛋白负责将复合物定点到靶DNA和剪切靶DNA。Cas9蛋白有6个结构域，分别是Rec
I、Rec II、Bridge Helix、PAM Interacting、HNH和RuvC。Rec
I是6个中最大的一个结构域，负责结合gRNA。...
通过mRNA体外转录载体获得的mRNA适用于体外翻译、生物化学研究、注射入细胞或胚胎后的蛋白表达、以及特定序列的其他mRNA应用。
该系统利用目的序列上游的T7启动子，通过T7噬菌体RNA聚合酶（T7
RNAP）和三磷酸核苷酸，在适当的反应条件下高效生成mRNA。我们建议您参考已发表文献中经测试的体外转录步骤说明来进行体外转录。
T7 RNAP对于有效的转录起始具有碱基要求，且这些碱基已经被放置到载体上。T7启动子3'末端的前两个碱基是GG，紧接着是客户的目的序列。
我们的mRNA体外转录载体会发生失控转录，这意味着T7
RNAP的转录能进行到DNA模板的末端，不会在质粒内的任何特定位点终止。因此，在体外转录之前，应通过使用SapI，BsiWI或AscI等限制性内切酶来单酶切线性化环状质粒，以确保转录物的长度和序列，这些单酶切位点紧邻poly（A）序列的下游。值得注意的是，待转录的序列不能含有所用线性化酶切位点，以免产生截短的mRNA。不纯的酶切产物可能会抑制随后的转录反应，因此建议通过柱子或酚氯仿来纯化酶切产物。...
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