云舟生物的高质量定制RNAi敲低文库可为大规模功能缺失筛选提供高效且经济的解决方案。shRNA文库可以以E. coli菌株、DNA或者病毒的形式交付。我们定制的文库都会进行NGS测序验证以确定文库的质量。
亮点
表 1. 文库构建服务价格与周期
| 服务 | 简述 | 价格（CNY） | 周期 |
|---|---|---|---|
| 设计文库构建策略 | shRNA载体骨架设计、shRNA序列设计 | 免费 | 1-4 天 |
| 文库质粒克隆（包括oligo合成和NGS验证） | 见表 2。 | ||
| 文库的病毒包装 | 点击此处了解更多病毒包装服务信息。文库质粒的病毒病毒包装价格是常规单质粒载体包装的1.5倍。 | ||
| 功能筛选样品的NGS测序分析 | 包括细胞样品基因组的NGS文库制备、llumina测序（> 500x覆盖率）和数据分析。 | ￥ 2,240/样本 | 3-5 周 |
表 2. 文库复杂度与文库载体克隆价格
| 文库复杂度 | 价格（CNY） | 周期 |
|---|---|---|
| 0 ~ 5x103 | ￥ 16,100起 | 5-8 周 |
| 5x103 ~ 104 | ￥ 31,500起 | |
| 104 ~ 5x104 | ￥ 38,500起 | 6-10 周 |
| 5x104 ~ 105 | ￥ 52,500起 | |
| >105 | 请咨询 | |
shRNA具有其特有的茎环结构，在RNA干扰（RNAi）过程中发挥着至关重要的作用，可精准降解mRNA。shRNA转录形成发夹结构后，可识别并降解靶mRNA。shRNA文库是大规模功能缺失筛选的强大工具。根据您的研究需求，云舟生物提供多种形式的shRNA文库，包括E. coli菌株、质粒DNA和包装好的病毒载体。这些文库都会进行NGS测序验证以确定文库的质量。
图 1 云舟生物shRNA敲低慢病毒载体
图 2. 慢病毒shRNA文库介导的功能缺失筛选流程图，摘自Acta Biochim Biophys Sin 44：103-112 (2012)
慢病毒shRNA文库介导的基因筛选常规流程如图2所示。首先，利用慢病毒shRNA文库转导靶细胞，并通过慢病毒载体上携带的筛选标记（例如药物选择或荧光标记）来筛选成功转导的阳性细胞。将阳性细胞分为对照组和实验组，对实验组进行压力选择（如药物处理或重复传代），筛选出具有目的表型的细胞。基因功能筛选策略通常有三种类型：1）活力筛选，筛选出shRNA富集或锐减的活细胞; 2）报告基因筛选，筛选出报告基因的表达强度与shRNA的富集有关的细胞（如靶向调节报道基因表达shRNA）；3）行为筛选，筛选出shRNA与细胞侵袭、迁移等基因相关的细胞。相对于对照组，实验组细胞筛选完成后，通过sanger测序或NGS测序鉴定出富集或锐减的shRNA。通过下游功能研究，进一步分析富集或消减的shRNA可能靶向的候选基因。
图3 shRNA均一性在人和小鼠精华基因小库（针对PubMed Central上约2,000个最常被引用的基因）中的分布。shRNA读长分布按NGS文库大小（1,000万reads）标准化，并以log2比例绘制。NGS测序深度为300x。
| 阵列筛选 | 文库筛选 | |
| 如何将shRNA导入靶细胞？ | 将不同的单个shRNA分别应用于多孔板（例如96孔或384孔）生长的细胞 | 数以千计不同的shRNA同时应用于一个细胞群体 |
| 如何鉴定与特定表型相关的shRNA？ | 应用于单孔的shRNA序列是已知的；需要逐一仔细筛查表现出特定表型的细胞或孔 | 从细胞集群中筛选出特定表型的细胞；需要通过测序鉴定出细胞中富集或锐减的shRNA序列 |
| 是否能检测遗传交互？ | 不能或者有限制（只有单个或几个shRNA添加到每个孔中） | 可以（细胞可能携带多个随机整合的shRNA） |
| 技术要求 | 高 | 低 |
| 人工试剂成本 | 高 | 低 |
| 特殊设备要求 | 高（例如液体处理器，高通量成像仪等） | 低（传统台式设备即可） |
我们设计和评估shRNA的规则与RNAi consortium（TRC）使用的规则类似。对于每个RefSeq转录本，我们会搜索出所有的21 mers作为候选靶位点。以下因素会降低干扰效率/特异性或影响克隆，含有这些特点的序列将会被排除。主要因素包括：含有≥4个连续相同碱基，含有≥7个G或C，GC含量<25％或> 60％以及序列的5'端含有AA碱基。如果靶点内部含有茎环结构，或是3'末端的GC含量较高，或是该靶点是已知的miRNA核心序列或是会打靶到其他基因，则该靶点的分值就会较低。若靶位点存在于一个基因的多个转录本，则该靶点的分值就会较高。
所有的干扰分值均≥0，平均数约为5，标准差约为5，95%的分值均≤15。若一个shRNA的干扰分值是15，则表示具有很高干扰效率且易于克隆；若干扰分值为0，则表示干扰效果较差或难以克隆。
请注意干扰分值只是一个参考值。实际的干扰效果可能会与预测的分值有偏差，低分值的shRNA也可能产生较好的干扰效果。同时，靶向转录本的 3’ UTR也可以起到干扰作用。
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