云舟生物的基因敲除稳转细胞株可实现对细胞基因组靶位点的永久敲除。我们的基因敲除细胞采用CRISPR相关技术制备，可引入单gRNA或者双gRNA靶向基因组，引发DNA双链断裂（DSB）。细胞对这些断裂的修复通常会导致移码突变或片段丢失，从而造成靶基因失活。
亮点：
图1 基因敲除细胞稳转株的构建流程。
| 服务 | 交付内容 | 价格(CNY) | 周期 |
|---|---|---|---|
| 基因敲除细胞稳转株构建（移码突变） | 两个纯合单克隆细胞株（>106个细胞/管，每个克隆各2管） | ￥15,980起 | 9-15周 |
| 基因敲除细胞稳转株构建（缺失突变） | 一个纯合单克隆细胞株（>106个细胞/管，2管） | ￥32,980起 | 9-15周 |
* 增加交付单克隆数将收取额外费用。
| 试验项目 | 方法 |
| 基因敲除验证（默认） | 基因型PCR、Sanger测序 |
| 表达测试（额外收费） | RT-qPCR、WB、IF、FACS |
| 脱靶效应分析（额外收费） | NGS、PCR、Sanger测序 |
| 染色体分析（额外收费） | 核型分析 |
| 无菌测试（默认） | PCR检测支原体、生物负荷检测等 |
图2 Huh-7细胞中CRISPR介导的单gRNA基因敲除。对细胞群进行Sanger测序，显示CRISPR靶位点处的有效突变（序列痕迹分解推断97.6%的序列包含突变）。
图3 RNP法验证基因敲除效率。通过gRNA-Cas9核糖核蛋白（RNP）方法获得纯合敲除突变。（A）编辑过的RNP复合物通过电转法导入靶细胞，分离单克隆细胞并筛选。使用PCR和Sanger测序验证细胞的基因型。（B）本案例在小鼠结肠癌细胞中进行基因编辑。RNP通过电转进入细胞后，可以结合靶基因的两个位点以敲除一段长13 kbp的区域。P1-P4四条引物用于三个PCR反应以区分敲除和野生型克隆。（C）PCR结果验证了克隆1中的纯合敲除突变，并进一步在（D）靶基因测序结果中得到印证。
对于CRISPR介导的基因编辑，Cas9核酸酶通过特异性的gRNA作用至靶位点以产生DNA切割。在大多数情况下，为了实现简单的基因敲除，可以将单个gRNA与Cas9共同使用以产生DSB，然后通过NHEJ进行低效率的DNA修复，从而导致序列发生永久性突变，比如产生基因的小片段插入或碱基缺失。这类突变的一部分会导致基因的阅读框移码、出现提前终止密码子等，最终导致目的基因的功能丧失。
双gRNA则一般用于结合Cas9(D10A)切口酶对靶位点的两条反向DNA链进行切割。在这种方法中，切口酶将在两条链上产生单链切割，每一条链上的切割位点通过两条gRNA中的一条引导，然后在靶位点产生DSB。一般来说，这种方法减少潜在的脱靶效应，因为该种DSB的产生要求两条gRNA同时靶向序列。
当使用Cas9(D10A)切口酶和外源供体 DNA 模板将特定的碱基（例如敲入）引入感兴趣的基因时，也可以使用双gRNA。在这种方法中，两条反向的DNA链将被两个gRNA靶向位于所需突变位点两侧的两个位点，然后通过HDR途径利用外源DNA供体模板来修复切除的序列。
为了确定哪种方法最适合您的实验应用，以下是您应该考虑的一些事项。
基本原理
基因敲低载体表达shRNA抑制靶基因的mRNA，通过引发mRNA的切割抑制翻译过程。shRNA敲低不改变靶基因的DNA序列。
CRISPR和TALEN都是通过指导核酸酶切割基因组中的特定靶位点来发挥作用。然后这些切割位点被细胞低效地修复，从而导致修复部位的永久性突变，比如产生基因的小片段插入或碱基缺失。这类突变的一部分会导致基因的阅读框移码、出现提前终止密码子等，最终导致目的基因的功能丧失。如果同时靶向基因组中两个相邻紧密的切割位点（距离几个kb），也可以导致其间区域的删除。
效率
shRNA敲低永远不会完全抑制靶基因的表达。即使对于最有效的shRNA，靶基因的一些残留表达也会保留。相比之下，在一小部分经过处理的细胞群中，CRISPR和TALEN可以产生永久性突变，这可能导致基因功能完全丧失。
一致性和均一性
shRNA载体通常在转染/转导的细胞时获得较好的均一性，实验之间的一致性也较佳。相比之下，由于引入突变是随机的，CRISPR和TALEN的基因编辑效果在细胞之间的差异相当大。为了完全敲除细胞中的目的基因，必须敲除细胞中基因的所有拷贝。鉴于正常细胞具有任何基因的两个拷贝（X或Y连锁基因除外），而癌细胞可以具有两个以上的拷贝，这种完全敲除的细胞可能只占所有处理后的细胞的一小部分。出于这个原因，核酸酶介导的敲除实验需要通过测序来筛选克隆，以确定所有目的基因拷贝都被敲除的子细胞群。
脱靶效应
已有报道表明shRNA介导的基因敲低和核酸酶介导的基因敲除均会产生脱靶效应。脱靶效应的表征可以通过使用多个不同的shRNA 靶向同一基因来评估。如果一个基因被在多个不同的shRNA作用下仍然表现出一致的表征，则这种表征通常则不是脱靶效应带来的。对于CRISPR或TALEN基因敲除，应分析含有功能丧失突变的多个克隆，以包含可能由脱靶突变引起的任何表征。此外，可以对克隆进行脱靶位点测序，通过生物信息学方法鉴定以查看它们是否已发生突变。
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