shRNA慢病毒套装

RNA干扰(RNA interference,简称RNAi)是一项强大的技术,能在多种细胞中有效地敲低基因表达水平,可用于研究基因功能。尽管RNAi的最简单方法是小干扰RNA(small interfering RNA,简称siRNA)寡核苷酸的胞质递送,但该技术仅限于能够转染的细胞,并且主要用于瞬时体外研究。通过慢病毒载体将短发夹RNA(short hairpin RNA,简称shRNA)引入哺乳动物细胞,可实现shRNA的稳定整合、靶基因的长期敲低,能感染分裂和非分裂细胞。

订购信息

注意:以上价格不包含载体构建费用

产品描述

病毒包装方式

第三代慢病毒(默认),第二代慢病毒

包膜蛋白

VSV-G(默认)、其他自定义

浓缩、纯化技术

PEG浓缩、蔗糖离心纯化等

运输条件

干冰

存储温度

-80°C,避免反复冻融

质量控制
  • 滴度测定
  • 微生物(细菌和真菌)检测
  • 支原体检测
  • 荧光表达情况检测
  • 内毒素水平检测
常见问题解答

为了测定慢病毒的滴度,我们使用系列稀释的慢病毒转导293T细胞,然后使用qPCR的方法来定量测定每个宿主细胞基因组(使用BMP2拷贝数作为内参)中病毒基因组(使用WPRE拷贝数作为参照)整合的平均拷贝数。这种方法能够测定病毒的功能滴度,精确地反映出具有感染能力的病毒颗粒的数量。另外,还有其他测定病毒滴度的方法,其中一种是对病毒基因组RNA直接进行RT-qPCR来测定,但这种方法会严重高估病毒的滴度(通常约10倍,有时高达100倍),因为它测量的是所有病毒的基因组,包括无活性的病毒颗粒。由于慢病毒本身的不稳定性,如果病毒不储存于-80℃或被反复冻融,都会使得无活性病毒颗粒增加。另一种方法是基于病毒载体上携带的荧光或药物筛选标记的表达量来测定转导细胞的数量。该方法可能会严重低估病毒滴度,因为荧光或药物筛选标记可能由于沉默或其他原因未能在一些宿主细胞中被检测到,而有的细胞可能会被多个病毒颗粒感染。

VectorBuilder设计和评估shRNA的规则与RNAi consortium(TRC)使用的规则类似。对于每个RefSeq转录本,我们会搜索出所有的21 mers作为候选靶位点。以下因素会降低干扰效率/特异性或影响克隆,含有这些特点的序列将会被排除。主要因素包括:含有≥4个连续相同碱基,含有≥7个G或C,GC含量<25%或> 60%以及序列的5'端含有AA碱基。如果靶点内部含有茎环结构,或是3'末端的GC含量较高,或是该靶点是已知的miRNA核心序列或是会打靶到其他基因,则该靶点的分值就会较低。若靶位点存在于一个基因的多个转录本,则该靶点的分值就会较高。 所有的干扰分值均≥0,平均数约为5,标准差约为5,95%的分值均≤15。若一个shRNA的干扰分值是15,则表示具有很高干扰效率且易于克隆;若干扰分值为0,则表示干扰效果较差或难以克隆。

请注意干扰分值只是一个参考值。实际的干扰效果可能会与预测的分值有偏差,低分值的shRNA也可能产生较好的干扰效果。同时,靶向转录本的 3’ UTR也可以起到干扰作用。

并不是所有的shRNA都会起作用

根据我们的经验和来自客户的反馈,使用3-4个shRNA进行干扰测试时,通常只有2-3个有比较合理的干扰效果。所以,在使用shRNA时,重要的是要认识到并非所有的shRNA都能正常工作。通常情况下,约50-70%的shRNA具有干扰效果,其中只有约20-30%的shRNA具有比较明显的效果。如果您使用几个shRNA靶向同一个基因都没有一个能产生满意的干扰效果,最好的解决方式是尝试更多的shRNA,特别是那些经过文献验证的shRNA。目前,许多研究人员使用靶向相同基因的shRNA库(即不同shRNA的混合物)进行实验,以期提高干扰效率。

干扰效率检测方法不当

最常用评估shRNA干扰效率的灵敏测定方法是RT-qPCR,您可能需要尝试几对引物,筛选出最具特异性和效率的引物对。通常情况下,RT-qPCR引物应跨越内含子,即设计在两个外显子上,以免扩增基因组DNA。当使用新引物时,建议您先进行预扩增实验,并将PCR产物进行电泳检测目的条带,或者甚至可以通过测序验证PCR产物是否正确。在进行RT-qPCR的同时,应注意设置minus-RT对照以评估基因组DNA的污染水平。您可以使用NCBI引物设计工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)来检查引物质量。

干扰效率也可以通过蛋白质印迹法(Western blot)进行评估。然而,该方法常产生来自非特异性抗体结合的假阳性条带,从而导致误判没有干扰效果。因此,在使用时需要确保抗体的特异性。

您使用的shRNA可能只打靶基因的某个转录本

在设计shRNA时,我们推荐您使用那些能靶向单个基因多个转录本的shRNA,除非您只想打靶特定转录本。VectorBuilder提供针对常见物种的shRNA数据库。当您将shRNA元件插入载体时,您可以选择shRNA数据库,通过搜索目的基因查看所有可用的shRNA详细信息。您还可以打开其中的UCSC链接,查看shRNA序列在基因组和转录本中位置等信息。

文档

使用说明书

慢病毒体外应用
慢病毒体内应用