shRNA腺病毒套装

RNA干扰(RNA interference,简称RNAi)是一项强大的技术,能在多种细胞中有效地敲低基因表达水平,可用于研究基因功能。尽管RNAi的最简单方法是小干扰RNA(small interfering RNA,简称siRNA)寡核苷酸的胞质递送,但该技术仅限于能够转染的细胞,并且主要用于瞬时体外研究。通过腺病毒载体将短发夹RNA(short hairpin RNA,简称shRNA)引入哺乳动物细胞,可实现shRNA的相对持久一点的瞬时表达(病毒基因组游离于细胞基因组存在),能感染分裂和非分裂细胞,主要用于体内研究。

订购信息

注意:以上价格不包含载体构建费用

产品描述

病毒包装方式

Ad5腺病毒、嵌合型腺病毒

浓缩、纯化技术

氯化铯(CsCl)密度梯度离心(超纯化级别)

运输条件

干冰

存储温度

-80℃,避免反复冻融

质量控制
  • 滴度测定
  • 微生物(细菌和真菌)检测
  • 支原体检测
  • 荧光表达情况检测
  • 内毒素水平检测
常见问题解答

对于非超纯化的腺病毒,我们采用基于免疫化学的方法通过检测腺病毒特异性六连体蛋白(Ad5 hexon protein)来检测病毒滴度。对于超纯化的腺病毒,我们通过测定病毒颗粒的光密度(OD260)测定病毒滴度。

VectorBuilder设计和评估shRNA的规则与RNAi consortium(TRC)使用的规则类似。对于每个RefSeq转录本,我们会搜索出所有的21 mers作为候选靶位点。以下因素会降低干扰效率/特异性或影响克隆,含有这些特点的序列将会被排除。主要因素包括:含有≥4个连续相同碱基,含有≥7个G或C,GC含量<25%或> 60%以及序列的5'端含有AA碱基。如果靶点内部含有茎环结构,或是3'末端的GC含量较高,或是该靶点是已知的miRNA核心序列或是会打靶到其他基因,则该靶点的分值就会较低。若靶位点存在于一个基因的多个转录本,则该靶点的分值就会较高。

所有的干扰分值均≥0,平均数约为5,标准差约为5,95%的分值均≤15。若一个shRNA的干扰分值是15,则表示具有很高干扰效率且易于克隆;若干扰分值为0,则表示干扰效果较差或难以克隆。

请注意干扰分值只是一个参考值。实际的干扰效果可能会与预测的分值有偏差,低分值的shRNA也可能产生较好的干扰效果。同时,靶向转录本的 3’ UTR也可以起到干扰作用。

并不是所有的shRNA都会起作用

根据我们的经验和来自客户的反馈,使用3-4个shRNA进行干扰测试时,通常只有2-3个有比较合理的干扰效果。所以,在使用shRNA时,重要的是要认识到并非所有的shRNA都能正常工作。通常情况下,约50-70%的shRNA具有干扰效果,其中只有约20-30%的shRNA具有比较明显的效果。如果您使用几个shRNA靶向同一个基因都没有一个能产生满意的干扰效果,最好的解决方式是尝试更多的shRNA,特别是那些经过文献验证的shRNA。目前,许多研究人员使用靶向相同基因的shRNA库(即不同shRNA的混合物)进行实验,以期提高干扰效率。

干扰效率检测方法不当

最常用评估shRNA干扰效率的灵敏测定方法是RT-qPCR,您可能需要尝试几对引物,筛选出最具特异性和效率的引物对。通常情况下,RT-qPCR引物应跨越内含子,即设计在两个外显子上,以免扩增基因组DNA。当使用新引物时,建议您先进行预扩增实验,并将PCR产物进行电泳检测目的条带,或者甚至可以通过测序验证PCR产物是否正确。在进行RT-qPCR的同时,应注意设置minus-RT对照以评估基因组DNA的污染水平。您可以使用NCBI引物设计工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)来检查引物质量。

干扰效率也可以通过蛋白质印迹法(Western blot)进行评估。然而,该方法常产生来自非特异性抗体结合的假阳性条带,从而导致误判没有干扰效果。因此,在使用时需要确保抗体的特异性。

您使用的shRNA可能只打靶基因的某个转录本

在设计shRNA时,我们推荐您使用那些能靶向单个基因多个转录本的shRNA,除非您只想打靶特定转录本。VectorBuilder提供针对常见物种的shRNA数据库。当您将shRNA元件插入载体时,您可以选择shRNA数据库,通过搜索目的基因查看所有可用的shRNA详细信息。您还可以打开其中的UCSC链接,查看shRNA序列在基因组和转录本中位置等信息。

文档

使用说明书

腺病毒体外应用
腺病毒体内应用