shRNA(IPTG诱导表达)慢病毒套装

载体家进一步改进shRNA过表达方法,开发出可使用IPTG诱导表达的shRNA慢病毒载体。该载体受用于乳糖操纵子(Lac operon, Lac O)负调控机制,并构建有两个表达框:一个是特别的shRNA表达框,使用人U6/2xLac O诱导型启动子;另一个则是Lac I基因/抗性基因表达框,使用组成型的PGK启动子。Lac I基因位于抗性基因上游,Lac I表达效率更高,有助减少shRNA泄露表达。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)是乳糖操纵子系统中常用的诱导剂。当环境中无IPTG时,U6/2xLac O启动子被Lac I 阻碍蛋白结合,shRNA转录抑制。添加IPTG后,阻碍蛋白构象改变并从Lac O序列释放,此时shRNA恢复正常表达。该载体与辅助质粒共同转染HEK293T包装细胞,生产出复制缺陷型的慢病毒颗粒。shRNA(IPTG诱导表达)慢病毒是假病毒化的,其包膜蛋白被替换为水泡性口炎病毒的G蛋白(VSV-G)。VSV-G假病毒化的慢病毒具有感染包括分裂与非分裂类型等多种哺乳动物细胞的优势。

订购信息

注意:以上价格不包含载体构建费用

产品描述

病毒包装方式

第三代慢病毒(默认),第二代慢病毒

包膜蛋白

VSV-G(默认)、其他自定义

浓缩、纯化技术

PEG浓缩、蔗糖离心纯化等

运输条件

干冰

存储温度

-80°C,避免反复冻融

质量控制
  • 滴度测定
  • 微生物(细菌和真菌)检测
  • 支原体检测
  • 荧光表达情况检测
  • 内毒素水平检测
试验验证

在IPTG诱导下,我们的shRNA(IPTG诱导表达)慢病毒载体表现出针对靶基因高效的敲低水平:

IPTG诱导的shRNA敲低EGFP

IPTG诱导的shRNA敲低EGFP。(A)基于U6启动子的IPTG诱导的EGFP shRNA表达盒位于慢病毒载体上,并被包装进病毒颗粒。慢病毒转导HEK293T细胞稳定表达EGFP。分别使用Puromycin和Blasticidin筛选分离转导阳性细胞,然后使用1 mM IPTG处理以诱导shRNA表达。使用流式细胞仪检测所有实验组的EGFP的中位荧光强度。(B)IPTG诱导表达shRNA的细胞中EGFP中位荧光强度在诱导后降低了约42%。该现象在Puromycin抗性和Blasticidin抗性的细胞中表现一致。IPTG诱导表达scramble shRNA不会对EGFP的中位荧光强度产生影响。此外。对于转导了缺失LacI抑制子基于的IPTG诱导型shRNA表达载体,载体的诱导表达功能丧失,且无论是否添加TPTG,EGFP表达均被打靶EGFP的shRNA抑制。

常见问题解答

shRNA(IPTG诱导表达)慢病毒载体是基于乳糖操纵子(Lac operon)的表达调控系统。该种shRNA慢病毒载体转导细胞后,位于两个LTR之间的载体区域被整合到细胞基因组上,这其中包含了所有Lac operon序列、Lac I基因和shRNA序列。Lac I基因以组成型方式表达Lac operon的转录阻碍物(Lac repressor)。Lac repressor与乳糖操纵子区域在结合进一步形成转录阻碍物复合体。Lac repressor是同源四聚体结构,含有2个DNA结合亚基,可同时结合多个lac operon。在IPTG诱导型shRNA慢病毒载体中,shRNA序列的上游U6启动子和转录终止信号下游均设计有lac operon序列。lac阻碍物因此可通过多种方式结合这些区域并在U6启动子下游转录区域形成DNA套环结构,从而阻止RNA 聚合酶的行进。

异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)是一种乳糖类似物,进入细胞后随即结合lac repressor并改变其构象。此时lac repressor从DNA链上释放,转录正常进行。由于细胞不会代谢IPTG,其浓度在实验中不改变,因此可作为该载体系统表达shRNA的诱导物。

shRNA(IPTG诱导表达)慢病毒转导哺乳动物细胞遵循常规的慢病毒转导方式。以293T细胞为例:

1. 慢病毒转导后,可进行药筛富集转导成功的细胞。

2. 将细胞分为实验组和对照组。往实验组中添加IPTG,终浓度1 mM。阴性对照组不添加IPTG。

3. 继续传代培养细胞8-10天,期间正常进行细胞换液。每次换液保持实验组添加有IPTG。

4. 往后即可观察或检测实验组相应的RNAi效果。

文档

使用说明书

慢病毒体外应用
慢病毒体内应用