CRISPRi慢病毒套装

除了基因组编辑之外，Cas9还可以充当基因表达的可编程阻遏物。仅两点突变即可产生没有剪切活性的Cas9（dead Cas9，简称dCas9）。在这个CRISPRi系统中，dCas9与KRAB和MeCP2阻遏域融合在一起，以进行强大的基因阻遏。与shRNA相比，CRISPRi可以沉默更多类型基因，如蛋白编码基因、非编码RNA、microRNA等。CRISPRi慢病毒套装包含2种病毒：gRNA慢病毒和dCas9-KRAB-MeCP2慢病毒。gRNA慢病毒携带Puromycin抗性基因，而dCas9-KRAB-MeCP2慢病毒携带Hygromycin抗性基因。进行实验时，使用Puromycin和Hygromycin两种抗生素筛选转导细胞。

订购信息

注意：以上价格和周期不包含载体构建

产品描述

病毒包装方式

第三代慢病毒（默认），第二代慢病毒

包膜蛋白

VSV-G（默认）、其他自定义

浓缩、纯化技术

PEG浓缩、蔗糖离心纯化等

运输条件

干冰

存储温度

-80℃，避免反复冻融

质量控制
  • 滴度测定
  • 微生物（细菌和真菌）检测
  • 支原体检测
  • 荧光表达情况检测
  • 内毒素水平检测
常见问题解答

与shRNA相比，CRISPRi基因沉默具有什么特点？▼

shRNA CRISPRi
工作原理 基因敲除能通过short hairpin RNAs（shRNAs）实现。shRNA表达后，被加⼯成small interfering RNAs（siRNAs）。这些siRNA被运到RNA-induced silencing complex（RISC）那里。接着，siRNA的反向链与正向链解开，正向链被降解、丢弃，反向链继续与RISC复合物结合，将有活性的RISC复合物引导⾄与反向链互补的mRNA。⼀旦反向链与mRNA完全互补结合，RISC复合物中的⼀个蛋白，argonaute，会剪切mRNA，从而抑制mRNA编码的蛋⽩翻译表达。 CRISPR interference（CRISPRi）技术采⽤了⼀个nuclease-dead Cas9蛋白（dCas9）与转录抑制因⼦组成的融合蛋白，例如Kruppel-associated box（KRAB）转录抑制因子。在这个融合蛋白里，dCas9仍然保留与DNA结合的活性，但是失去了核酸酶活性。dCas9融合蛋⽩在⼀条guide RNA（gRNA）引导下，结合至目标基因的transcriptional start site（TSS）区域，从而阻遏该基因的转录。
目标分子 成熟mRNA 基因的TSS区域
打靶事件发⽣位置 细胞质 细胞核
抑制基因种类 mRNA编码基因、胞质lncRNA mRNA编码基因（针对因转录本太短而不能设计出有效shRNA的基因，可选择CRISPRi技术）、胞质lncRNA、核内lncRNA
脱靶⻛险

RNAi存在2类脱靶：序列相关性和非序列相关性

序列相关性脱靶：

仅凭有限的部分碱基互补，siRNA就能引起非目标mRNA的沉默。

取决于siRNA序列，⼀个siRNA可能抑制成百上千条转录本。

非序列相关性脱靶：

shRNA采⽤内源miRNA通路实现基因敲除。当⼤量shRNA导⼊细胞后，它们使RNAi系统达到饱和，并与内源miRNA竞争蛋白，例如Dicer、RISC和其它因子。由此，那些内源miRNA介导的基因调控受到干扰，导致不可以预期的脱靶。

 与shRNA相比，CRISPRi的脱靶机率超低。
可逆的基因抑制 如使⽤质粒载体或者合成的siRNA，基因沉默是可逆的。如使⽤整合型病毒载体（如：慢病毒载体）实现结构性表达shRNA，则沉默非可逆性。 如使⽤质粒载体或者合成的dCas9融合蛋白/gRNA，基因沉默是可逆的。如使⽤整合型病毒载体（如：慢病毒载体）实现结构性表达dCas9融合蛋白和gRNA，则沉默非可逆性。如沉默重要的基因，推荐使⽤TetOn诱导表达CRISPRi慢病毒载体，可通过药物控制这些基因的沉默。

如何计算gRNA特异性分值？▼

我们使用的gRNA设计和评分规则与张峰实验室开发的运算规则类似。简而言之，对于每个物种，我们找出符合N(20)NGG规则的靶序列，把错配碱基 ≤3的序列列为潜在的脱靶位点，计算出每个gRNA的脱靶分值，进而得出最终的gRNA特异性分值。gRNA特异性分值在0-100之间，分值越大靶向特异性越高。

请注意特异性分值只是一个参考值。实际的靶向效率和特异性可能会与预测的分值有偏差，低分值的gRNA也可能有较好的靶向效果。

文档

使用说明书

转染用慢病毒载体
慢病毒体外应用
慢病毒体内应用