CRISPRi慢病毒套装

除了基因组编辑之外,Cas9还可以充当基因表达的可编程阻遏物。仅两点突变即可产生没有剪切活性的Cas9(dead Cas9,简称dCas9)。在这个CRISPRi系统中,dCas9与KRAB和MeCP2阻遏域融合在一起,以进行强大的基因阻遏。与shRNA相比,CRISPRi可以沉默更多类型基因,如蛋白编码基因、非编码RNA、microRNA等。CRISPRi慢病毒套装包含2种病毒:gRNA慢病毒和dCas9-KRAB-MeCP2慢病毒。gRNA慢病毒携带Puromycin抗性基因,而dCas9-KRAB-MeCP2慢病毒携带Hygromycin抗性基因。进行实验时,使用Puromycin和Hygromycin两种抗生素筛选转导细胞。

订购信息

注意:以上价格不包含载体构建费用

产品描述

病毒包装方式

第三代慢病毒(默认),第二代慢病毒

包膜蛋白

VSV-G(默认)、其他自定义

浓缩、纯化技术

PEG浓缩、蔗糖离心纯化等

运输条件

干冰

存储温度

-80℃,避免反复冻融

质量控制
  • 滴度测定
  • 微生物(细菌和真菌)检测
  • 支原体检测
  • 荧光表达情况检测
  • 内毒素水平检测
常见问题解答
shRNA CRISPRi
工作原理 基因敲除能通过short hairpin RNAs(shRNAs)实现。shRNA表达后,被加⼯成small interfering RNAs(siRNAs)。这些siRNA被运到RNA-induced silencing complex(RISC)那里。接着,siRNA的反向链与正向链解开,正向链被降解、丢弃,反向链继续与RISC复合物结合,将有活性的RISC复合物引导⾄与反向链互补的mRNA。⼀旦反向链与mRNA完全互补结合,RISC复合物中的⼀个蛋白,argonaute,会剪切mRNA,从而抑制mRNA编码的蛋⽩翻译表达。 CRISPR interference(CRISPRi)技术采⽤了⼀个nuclease-dead Cas9蛋白(dCas9)与转录抑制因⼦组成的融合蛋白,例如Kruppel-associated box(KRAB)转录抑制因子。在这个融合蛋白里,dCas9仍然保留与DNA结合的活性,但是失去了核酸酶活性。dCas9融合蛋⽩在⼀条guide RNA(gRNA)引导下,结合至目标基因的transcriptional start site(TSS)区域,从而阻遏该基因的转录。
目标分子 成熟mRNA 基因的TSS区域
打靶事件发⽣位置 细胞质 细胞核
抑制基因种类 mRNA编码基因、胞质lncRNA mRNA编码基因(针对因转录本太短而不能设计出有效shRNA的基因,可选择CRISPRi技术)、胞质lncRNA、核内lncRNA
脱靶⻛险

RNAi存在2类脱靶:序列相关性非序列相关性

序列相关性脱靶:

仅凭有限的部分碱基互补,siRNA就能引起非目标mRNA的沉默。

取决于siRNA序列,⼀个siRNA可能抑制成百上千条转录本。

非序列相关性脱靶:

shRNA采⽤内源miRNA通路实现基因敲除。当⼤量shRNA导⼊细胞后,它们使RNAi系统达到饱和,并与内源miRNA竞争蛋白,例如Dicer、RISC和其它因子。由此,那些内源miRNA介导的基因调控受到干扰,导致不可以预期的脱靶。

与shRNA相比,CRISPRi的脱靶机率超低。
可逆的基因抑制 如使⽤质粒载体或者合成的siRNA,基因沉默是可逆的。如使⽤整合型病毒载体(如:慢病毒载体)实现结构性表达shRNA,则沉默非可逆性。 如使⽤质粒载体或者合成的dCas9融合蛋白/gRNA,基因沉默是可逆的。如使⽤整合型病毒载体(如:慢病毒载体)实现结构性表达dCas9融合蛋白和gRNA,则沉默非可逆性。如沉默重要的基因,推荐使⽤TetOn诱导表达CRISPRi慢病毒载体,可通过药物控制这些基因的沉默。

我们使用的gRNA设计和评分规则与张峰实验室开发的运算规则类似。简而言之,对于每个物种,我们找出符合N(20)NGG规则的靶序列,把错配碱基 ≤3的序列列为潜在的脱靶位点,计算出每个gRNA的脱靶分值,进而得出最终的gRNA特异性分值。gRNA特异性分值在0-100之间,分值越大靶向特异性越高。

请注意特异性分值只是一个参考值。实际的靶向效率和特异性可能会与预测的分值有偏差,低分值的gRNA也可能有较好的靶向效果。

文档

使用说明书

转染用慢病毒载体
慢病毒体外应用
慢病毒体内应用