CRISPR慢病毒套装

CRISPR/Cas9系统可以通过NHEJ途径敲除目的基因,或通过同源重组敲除、敲入或标记基因。慢病毒载体是高效的载体,可在广泛的用途中提供CRISPR/Cas9,包括在复杂的实验条件下(例如难治性细胞、体内靶标或转基因)。我们提供传统和非整合型两种CRISPR慢病毒。传统的慢病毒载体能将CRISPR/Cas9系统整合到细胞基因组中,随细胞分裂而分裂,实现Cas9和gRNA的长期稳定表达。由于突变了整合酶基因,进入细胞后的非整合型慢病毒,没有了整合酶的帮助,原病毒DNA不能插入细胞基因组,而是作为非复制型游离体存在于转导细胞中,Cas9和gRNA不能持续表达,降低脱靶风险。

订购信息

注意:以上价格不包含载体构建费用

产品描述

病毒包装方式

第三代慢病毒(默认),第二代慢病毒

包膜蛋白

VSV-G(默认)、其他自定义

浓缩、纯化技术

PEG浓缩、蔗糖离心纯化等

运输条件

干冰

存储温度

-80℃,避免反复冻融

质量控制
  • 滴度测定
  • 微生物(细菌和真菌)检测
  • 支原体检测
  • 荧光表达情况检测
  • 内毒素水平检测
常见问题解答

为了测定慢病毒的滴度,我们使用系列稀释的慢病毒转导293T细胞,然后使用qPCR的方法来定量测定每个宿主细胞基因组(使用BMP2拷贝数作为内参)中病毒基因组(使用WPRE拷贝数作为参照)整合的平均拷贝数。这种方法能够测定病毒的功能滴度,精确地反映出具有感染能力的病毒颗粒的数量。另外,还有其他测定病毒滴度的方法,其中一种是对病毒基因组RNA直接进行RT-qPCR来测定,但这种方法会严重高估病毒的滴度(通常约10倍,有时高达100倍),因为它测量的是所有病毒的基因组,包括无活性的病毒颗粒。由于慢病毒本身的不稳定性,如果病毒不储存于-80℃或被反复冻融,都会使得无活性病毒颗粒增加。另一种方法是基于病毒载体上携带的荧光或药物筛选标记的表达量来测定转导细胞的数量。该方法可能会严重低估病毒滴度,因为荧光或药物筛选标记可能由于沉默或其他原因未能在一些宿主细胞中被检测到,而有的细胞可能会被多个病毒颗粒感染。

我们使用的gRNA设计和评分规则与张峰实验室开发的运算规则类似。简而言之,对于每个物种,我们找出符合N(20)NGG规则的靶序列,把错配碱基 ≤3的序列列为潜在的脱靶位点,计算出每个gRNA的脱靶分值,进而得出最终的gRNA特异性分值。gRNA特异性分值在0-100之间,分值越大靶向特异性越高。

请注意特异性分值只是一个参考值。实际的靶向效率和特异性可能会与预测的分值有偏差,低分值的gRNA也可能有较好的靶向效果。

对于CRISPR介导的基因组编辑,Cas9核酸酶靶向位点特异性引导RNA(gRNA)的靶位点以产生DNA切割。在大多数情况下,为了产生简单的基因敲除,可以将单个gRNA与Cas9一起使用以产生双链断裂(DSB),并通过非同源末端连接(NHEJ)低效修复,导致永久突变 ,如在修复位点产生小插入或缺失。某些突变会产生移码,终止密码子提前出现等,从而导致目的基因功能缺失。如果基因组中两个临近的位点(如小于几kb)同时作为靶向位点,使用双gRNA可能会导致中间区域片段的缺失(即片段敲除)。

如果使用Cas9_D10A缺刻酶靶向单个靶位点的两条相对链,则可以使用双gRNA。缺刻酶将在两条链上产生单链切割,两条gRNA分别引导缺刻酶在对应的一条链上进行切割,从而引起靶位点处发生DSB。 通常情况下,这种方法可以减少CRISPR/Cas9的脱靶效应,因为需要两个gRNA同时打靶才能产生DSB。

当使用Cas9_D10A缺刻酶和外源Donor DNA模板将特定碱基(例如敲入)引入目的基因时,也可以使用双gRNA。两个gRNA靶向位于所需突变位点侧翼的两条相对链,然后通过同源定向修复(HDR)的方法利用外源模板来修复被切除的序列。

文档

使用说明书

慢病毒体外应用
慢病毒体内应用