MMLV逆转录病毒包装

莫洛尼氏鼠白血病逆转录病毒(Moloney murine leukemia retrovirus,简称MMLV)是第一个被广泛使用的基因转移载体,并且是第一个使用ex vivo策略治疗遗传性疾病的载体(R.M. Blaese 1995)。使用逆转录病毒载体的优势之一是载体基因组永久整合到宿主基因组中,可长期稳定地表达转基因。MMLV逆转录病毒只能感染分裂的细胞,主要原因是它们无法穿过核膜,只能在细胞分裂过程中通过不完整的核膜来完成感染。MMLV逆转录病毒的生产需要在一个包装细胞中,从单独的包装质粒中反式表达病毒Gag、Pol和Env蛋白。我们开发出一系列专有技术和试剂,从病毒滴度、纯度、活性以及一致性等方面显著提升了逆转录病毒包装工艺水平。

订购信息
病毒类型

我们提供2种逆转录病毒包装服务:

  • VSV-G假病毒化的MMLV逆转录病毒,利用5’ LTR表达目的基因;
  • VSV-G假病毒化的SIN (Self-inactivation)MMLV逆转录病毒,利用internal promoter表达目的基因。
交付内容
非纯化MMLV逆转录病毒制备服务 纯化MMLV逆转录病毒制备服务
交付内容

定制病毒,按照规格交付:

  • ⼩量制备:>107TU/ml,10 x 25 ul
  • 中量制备:>107TU/ml,10 x 100 ul
  • ⼤量制备:>108TU/ml,10 x 100 ul

定制病毒,按照规格交付:

  • ⼤量制备:>108TU/ml,10 x 100 ul

对照病毒,按照定制病毒的规格对应赠送:

  • ⼩量制备:>107TU/ml,100 ul
  • 中量制备:>107TU/ml,2 x 100 ul
  • ⼤量制备:>108TU/ml,2 x 100 ul

对照病毒,按照定制病毒的规格对应选购:

  • ⼤量制备:>108TU/ml,10 x 100 ul
Polybrene(5 mg/ml,200 ul),赠送 Polybrene(5 mg/ml,200 ul),赠送
病毒重悬液 HBSS缓冲液 HBSS缓冲液
运输/存储 干冰/-80°C,避免反复冻融 干冰/-80°C,避免反复冻融
推荐应用 体外培养细胞转导 体外培养细胞转导、动物体内细胞转导

对照病毒

为了更好地开展您的实验,我们按照“对照病毒与定制病毒的生物学应用相匹配”的原则给您赠送或者推荐对照病毒。例如,如果定制病毒表达一个基因,则推荐的对照病毒表达荧光蛋白EGFP。推荐的对照病毒信息如下表所示:

对照病毒 对照载体名称 对照载体ID 定制病毒
EGFP对照MMLV逆转录病毒, Puro抗性 pMMLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro VB170316-1032yra 哺乳动物基因表达MMLV逆转录病毒、哺乳动物非编码RNA表达MMLV逆转录病毒
运输/储存

我们的MMLV逆转录病毒存储在HBSS缓冲液中,并采用干冰运输。收到病毒后,立即放置于-80℃,长期贮存至少6个月。MMLV逆转录病毒的保质期约为一年。请避免反复冻融,因为这会导致病毒滴度大幅下降。

生产/质控
步骤 描述 时间

Co-transfection

我们常规使用的MMLV逆转录病毒包装系统包括1个转移质粒(Transfer plasmid)、1个膜蛋白表达质粒(Envelope plasmid)、2个包装质粒(Packaging plasmids),将这些质粒共转染包装细胞。2个包装质粒分别为Gag/Pol表达质粒和Rev表达质粒。 第1天

Supernatant collection

在细胞里,转移质粒转录出携带目的基因(Gene of Interest,简称GOI)的MMLV RNA基因组,与包装质粒表达出的衣壳结构蛋白、酶、调控蛋白组装成病毒颗粒后,转运到细胞膜内侧,形成包膜病毒分泌到胞外。膜蛋白质粒表达的VSV-G膜蛋白锚定在细胞膜上,随着病毒成熟,与细胞膜一起成为了病毒的膜。细胞短暂孵育后,收集上清,离心去除细胞碎片并过滤。 第3天

Concentration and purification

PEG浓缩病毒颗粒。对于超纯化MMLV逆转录病毒(体内应用级别),采用蔗糖离心方法进一步纯化、浓缩病毒。 第4天

Quality Control

对病毒进行滴度测定(Titer determination)、微生物检测(Bioburden test,针对细菌、真菌)、支原体检测(Mycoplasma test)等。

若转移载体同时编码一个荧光蛋白,我们还会将病毒进行细胞转导以测定相应的荧光表达情况(Transduction test)。此外,对于超纯化MMLV逆转录病毒,我们还可以检测内毒素水平(Endotoxin test)。

第5天及以后
滴度保证

我们的滴度保证仅适用于包装进病毒的区域(从5’ LTR的R元件的第一个碱基到3’ LTR的R元件的最后一个碱基)小于MMLV逆转录病毒承载限度(8 kb,~野生型MMLV逆转录病毒基因组长度)的载体。超过该范围,载体也许会被包装进病毒,但会造成病毒滴度降低。此外,对于如下载体,我们同样不能保证滴度:

  • 包含对包装过程有不利影响的序列,例如毒性基因(如促凋亡基因、针对MMLV的host factors);破坏包装细胞或病毒的完整性(如导致细胞聚集的膜蛋白、含有polyA信号序列)的基因;易于重排或者产生二级结构的序列(如重复序列或者高GC含量序列)。
  • 用户提供的载体,因为我们无法控制载体质量。
交付周期

交付周期是指订单接收到发货之间的时间,不包括需要客户提供任何物料(如病毒载体)的等待时间。

客户提供载体

如需客户提供慢病毒载体,则请按照外来物品接收指南将载体寄送给我们。请严格按照我们的指南来进行装运以免造成物品的任何延误和损坏。客户提供的所有材料均需经过QC检测,每一份材料附加检测费用。请注意,客户提供物品接收并通过QC之后生产才正式开始。

视频

暂无

文档

使用说明书

MMLV逆转录病毒

您可以在我们的产品标签或包装上找到产品批号。

常见问题解答
慢病毒 MMLV 腺病毒 AAV
组织嗜性 广泛 广泛 hAd5只感染表达CAR受体的细胞 取决于血清型
是否可感染非分裂细胞
病毒基因组稳定整合抑或游离于宿主基因组 稳定整合 稳定整合 游离的DNA附加体形式 游离的DNA附加体形式
滴度 中等 非常高
自定义启动子
应用 细胞培养和体内实验 细胞培养和体内实验 体内实验 体内实验
体内免疫反应 非常低