HSV病毒载体

重组单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus , HSV)是当今富有应用前景的基因治疗和肿瘤治疗病毒载体。重组HSV在神经系统溶瘤基因转导和疫苗开发(针对肿瘤、HSV以及多种其他疾病)方面有着广泛的应用。重组HSV具备相当多的优点,如嗜神经特性、长潜伏期、游离体形式存在于整个宿主细胞生命周期以及极大的载体容量,因此是体内和体外基因转导实验的理想病毒载体。

载体家的HSV载体经过特别设计,可用于重构包括野生型、减毒型以及复制缺陷型的扩增子形式的一系列HSV活病毒。我们还可以提供研究级和GMP级别的HSV病毒包装。

HSV载体相关服务:

载体家提供的HSV载体构建和病毒包装服务如下:

  • HSV-1载体(17型、F型和KOS毒株),使用载体家独有的BACYAC骨架
  • HSV-2载体(HG52毒株),使用载体家独有的BACYAC骨架
  • HSV-1扩增子,使用质粒载体骨架
  • HSV-1和HSV-2病毒包装
HSV BACYAC骨架

载体家自主研发的“BACYAC”骨架专门为HSV载体克隆而设计。该骨架整合了细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)的关键元件。BAC相关元件允许该载体可以在大肠杆菌中以BAC形式扩增,而YAC相关元件允许该载体在酿酒酵母中复制BACYAC载体因此可灵活地在大肠杆菌系统和酵母系统中进行载体扩增和序列修饰。

BACYAC骨架可以插入LacZ或EGFP报告基因以便于转染细胞后的识别。骨架上含有一对LoxP位点,可在Cre重组酶作用下拼接出最终的病毒基因组序列。

HSV BACYAC载体的基本设计如图1所示。

图1 含有EGFP和LacZ报告基因的BACYAC骨架

TRL/IRL长片段侧翼的末端和反向重复序列,通过“a”序列(黑色)重组连接并形成4种异构体。

TRS/IRS短片段侧翼的末端和反向重复序列,通过“a”序列(黑色)重组连接并形成4种异构体。

UL/US编码HSV基因的特殊长片段和短片段。

UL37/UL38:HSV UL37和UL38基因。UL37和UL38之间插入外源DNA可引起HSV毒力的微小变化。

LoxP:Cre重组酶作用的重组位点。两个LoxP之间的序列可以被Cre重组酶剪切下来。

EGFP或LacZ报告基因: CMV启动子驱动表达的EGFP和LacZ报告基因,用于识别转染成功的细胞。

BACYAC骨架:整合了细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)的载体骨架,可以在大肠杆菌种携带氯霉素抗性基因选择性扩增,也可以在酿酒酵母中使用His3自噬选择标记进行扩增。

我们可以构建含有野生型HSV-1(17型、F型和KOS毒株)和HSV-2(HG52毒株)基因组的HSV BAC载体。此外我们也提供基于BAC修饰原理的HSV突变服务。对HSV病毒复制相关基因进行序列删除或点突变可以制备复制缺陷型HSV;对HSV非关键基因进行序列删除或点突变可以制备减毒型HSV。

实验验证

我们的HSV载体经详尽验证可以稳定用于生产活病毒。图2与图3分别显示使用我们的BACYAC载体成功包装出的野生型HSV病毒颗粒以及随后用其转导靶细胞的效果。

图2 携带野生型HSV-1(KOS毒株)全长基因组序列的BACYAC载体(含有EGFP报告基因)转染Vero细胞。转染后72小时进行拍照。细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)见于红色箭头处,死细胞发生团聚并且呈现出球形形态和反光率增强现象。这种现象可用于指示活病毒的存在。放大倍数:100X。左:明场。右:EGFP。

图3 使用我们生产的HSV病毒颗粒(KOS毒株)转导Vero细胞。转导后48小时进行拍摄。放大倍数:100X。左:明场。右:EGFP。

HSV扩增子载体

载体家的HSV-1扩增子载体包含最小病毒基因组序列:复制起点(oriS)、包装信号序列(pac)以及一个或多个目的基因。通过利用辅助质粒(携带有整个HSV-1基因组但是无包装信号序列的BACYAC载体),扩增子载体可以包装出复制缺陷型的但是具备感染能力的HSV病毒颗粒。

HSV扩增子载体的基本设计如图4所示。

图4 HSV-1扩增子载体

Promoter:启动子序列,驱动目的基因表达。

Kozak:Kozak共有序列,放置于ORF前端有助于原核细胞中的翻译起始。

ORF:目的基因的开放阅读框。

BGH pA: 牛生长激素多聚腺苷酸信号序列(Bovine growth hormone polyadenylation signal)。由启动子驱动的转录过程将在该序列处终止。

HSV-1 pac:HSV-1包装信号,在病毒DNA包装进入病毒颗粒过程中发挥作用。

Ampicillin:氨苄青霉素抗性基因。携带该基因的质粒在E. coli中可以使用氨苄青霉素选择性扩增。

pUC ori:pUC复制起点,携带该元件的质粒可以在E. coli中高拷贝复制。

oriS:HSV-1 DNA复制起点。携带该元件的质粒以多连体DNA形式包装进入HSV-1病毒颗粒。

IE4/5:HSV-1 ICP22和ICP47中早期基因启动子。该启动子的激活取决于顺式HSV-1包膜蛋白VP16。该启动子可以驱动下游标记基因表达,同时也作为激活oriS功能的转录调控序列。

Marker:标记基因(如EGFP、LacZ),用于分辨转染成功的细胞

SV40 early pA:猿猴空泡病毒40早期多聚腺苷酸信号序列(Simian vacuolating virus 40 early polyadenylation signal),有助于上游ORF序列的转录中止。

HSV在基因治疗中的优势

HSV是基因组为双链DNA的包膜病毒,且具备多项应用于基因治疗的优势:

广泛的组织嗜性:HSV可以转导分裂和非分裂细胞。HSV同时也是天然的嗜神经病毒,可以借助轴突逆行运输,因此通过感染注射位点的神经末梢即可进行基因递送。HSV由此也是理想的治疗特定神经疾病的理想载体。

潜伏感染:HSV在神经元中长期保持潜伏状态,不会产生显著副作用。这种特点让HSV可以逃避宿主免疫系统并且可以在宿主细胞的生命周期中长期留存。HSV具有在神经元中稳定表达目的基因的优势,特别是对于那些要求长期表达的研究。

最小化插入突变风险:当保持潜伏方式感染状态时,HSV以游离体的形式存在,不整合宿主基因组,因此最小化了插入突变的风险。

可以使用组织培养基扩增:HSV可以应用组织培养基扩增,方法简单且显示出在多种动物模型形成潜伏感染的能力。

载体容量大:HSV拥有巨大的病毒基因组,包含超过80个基因,其中一些对于病毒复制是非关键的。这种特点给研究者提供了高度的操作灵活性,例如可以删除掉非关键基因并利用空间插入大片段或多个目的基因。

常用的HSV载体

HSV载体大致可以划分为以下几类:

HSV BAC 载体

HSV BAC载体是通过在真核细胞中使用同源重组方式将BAC骨架插入HSV基因组的方式制备的。选择标记如EGFP有助于正确纯化出插入了BAC序列的重组病毒。疱疹病毒基因组在宿主细胞中倾向于形成环状DNA,并在细胞核内部产生复制中间产物。这些DNA将被分离出来并用以转化大肠杆菌。BAC骨架上含有抗生素抗性基因,有助于在大肠杆菌中选择性扩增HSV BAC载体。最后的步骤则是从大肠杆菌中分离出HSV BAC载体,并使用酶切和测序分析进行质检。通过质检的HSV BAC载体将被转染至容许性细胞用于生产活病毒。

HSV病毒基因组巨大,使用常规质粒载体克隆HSV基因组是不合适的。BAC载体另一方面由于可以插入大片段DNA序列和较慢的复制速率的特点,因此是HSV研究的更佳选择。使用HSV BAC在大肠杆菌中扩增,对比使用容许性细胞扩增临床分离株的方式更能保障病毒序列的稳定性。

尽管HSV BAC具备上述所示的多种优点,但是也存在一些不足之处值得考虑。使用HSV BAC需要首先检查其序列不含有由于病毒基因组重复序列天然的不稳定性造成的突变。此外,插入BAC骨架的HSV基因组造成的病毒基因组大小增加也会抑制病毒生长。因此,理想的方法是设计HSV BAC载体时在BAC两侧引入loxP或FRT位点,允许必要时分别通过Cre-或者Flp-重组系统移除BAC骨架。

HSV扩增子载体

扩增子是基于HSV-1的质粒载体,包含一个或多个目的基因以及最小病毒基因组序列。在HSV-1辅助病毒或者HSV-1基因组克隆提供的顺式元件辅助下,扩增子序列可以被包装进HSV活病毒颗粒。扩增子只含有两段病毒序列:一个是oriS复制起点,允许病毒病毒在包装细胞中复制;另一个是pac序列,即包装信号序列,在病毒的包装过程中起作用。HSV病毒颗粒组分来自于扩增子基因组。扩增子使用类似滚环复制的机制进行复制,与野生型HSV-1的头尾相连的多连体DNA相似,最终生成串联形式的含有多个扩增子的重复序列。

扩增子载体具备多种用于基因转染工具的优点,例如极大的载体容量(可达150 kb),易于克隆,以及可以转染大量类型的细胞和较高的转导效率,此外,病毒蛋白编码序列的缺失导致扩增子载体转染细胞核组织后完全无毒性和无致病性。缺少病毒基因的扩增子载体同时也可以最小化其被宿主细胞中潜伏的病毒基因组重新激活或发生序列重组的机会。

长期以来,使用扩增子进行基因治疗的主要瓶颈在于生产高滴度的扩增子病毒时易携带有辅助病毒成分。被辅助病毒污染的扩增子病毒悬液在应用于基因治疗时会导致潜在的细胞毒性和炎症反应,因此是不被接受的。开发无辅助病毒的包装系统,比如使用包含HSV-1基因组但是移除了包装信号序列的一组重叠的黏粒(Cosmid)或者一个BAC载体来代替辅助病毒用于包装,能够很好地克服这种污染问题。这种方法可以生产出无辅助病毒成分的扩增子病毒悬液,但是制备的病毒滴度并不高。另一种方法是,使用Cre-lox技术在病毒生产细胞中删除辅助病毒的包装信号序列,从而获得具备更低辅助病毒污染的高滴度扩增子病毒。然而此种方法仍然包含极低水平的辅助病毒污染,可能难以应用于某些特定的基因治疗领域。

常见问题解答

HSV具有天然的神经嗜性,使用扩增子载体时可提供高达150kb的装载容量,并且可以在宿主细胞中保持终生的潜伏状态。这种特点让HSV对比慢病毒、AAV和腺病毒时具有独特的优势。此外,HSV的优势还包括:具有广泛的宿主细胞感染能力、在细胞中保持附加体的存在形式不整合宿主基因组、易于在细胞培养基中扩增、可包装出高滴度的病毒等。

经过大量的试验测试,我们提供的HSV BACYAC载体和HSV扩增子载体均可用于生产活HSV病毒。HSV BACYAC载体可通过转染病毒易感的真核细胞(如Vero细胞)来生产活病毒。扩增子载体则可以通过与包含失活型HSV-1基因组的BAC共转染包装细胞来生产活病毒。

HSV载体可以在生物安全2级(BSL-2)实验室进行操作。但是由于生物安全政策在不同的机构中可能有所差异,我们建议研究者需要根据自身所处机构的生物安全指引来操作所有病毒载体。