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腺相关病毒包装
腺相关病毒（Adeno-associated virus，简称AAV）是一种对人类没有致病性的细小病毒（Parvovirus）。虽然AAV感染在人类中很常见，但与任何已知疾病无关；加上其转导分裂细胞和静止细胞的能力、非常低的免疫原性以及转基因长期表达（与野生型AAV病毒感染后整合到宿主细胞DNA不同，重组AAV载体主要作为染色体外游离体长期存在），这些特性使AAV成为炙手可热的用于基因治疗的病毒载体。我们开发出一系列专有技术和试剂，从病毒滴度、纯度、活性以及一致性等方面显著提升了腺相关病毒包装工艺水平。
订购信息
ssAAV
scAAV
Baculovirus-Based Approach
| 生产规格 | Unit Size | 最小滴度 | 分装 | 价格（CNY） | 周期 |
| ssAAV病毒⼩量制备 | >5 x 1010 GC | >2 x 1011 GC/ml | 10 x 25 ul | ￥3,100.00 | 10-18天 |
| ssAAV病毒中量制备 | >2 x 1011 GC | >2 x 1011 GC/ml | 10 x 100 ul | ￥4,600.00 | 10-18天 |
| ssAAV病毒大量制备 | >2 x 1012 GC | >2 x 1012 GC/ml | 10 x 100 ul | ￥7,700.00 | 10-18天 |
| 超纯化ssAAV病毒⼩量制备 | >1 x 1012 GC | >1 x 1013 GC/ml | 4 x 25 ul | ￥9,300.00 | 16-26天 |
| 超纯化ssAAV病毒中量制备 | >5 x 1012 GC | >1 x 1013 GC/ml | 10 x 50 ul | ￥11,300.00 | 16-26天 |
| 超纯化ssAAV病毒⼤量制备 | >1 x 1013 GC | >1 x 1013 GC/ml | 10 x 100 ul | ￥16,900.00 | 16-26天 |
| 生产规格 | Unit Size | 最小滴度 | 分装 | 价格（CNY） | 周期 |
| scAAV病毒⼩量制备 | >5 x 1010 GC | >2 x 1011 GC/ml | 10 x 25 ul | ￥3,100.00 | 10-18天 |
| scAAV病毒中量制备 | >2 x 1011 GC | >2 x 1011 GC/ml | 10 x 100 ul | ￥4,600.00 | 10-18天 |
| scAAV病毒大量制备 | >2 x 1012 GC | >2 x 1012 GC/ml | 10 x 100 ul | ￥7,700.00 | 10-18天 |
| 超纯化scAAV病毒⼩量制备 | >1 x 1012 GC | >1 x 1013 GC/ml | 4 x 25 ul | ￥9,300.00 | 16-26天 |
| 超纯化scAAV病毒中量制备 | >5 x 1012 GC | >1 x 1013 GC/ml | 10 x 50 ul | ￥11,300.00 | 16-26天 |
| 超纯化scAAV病毒⼤量制备 | >1 x 1013 GC | >1 x 1013 GC/ml | 10 x 100 ul | ￥16,900.00 | 16-26天 |
| 生产规格 | Unit Size | 最小滴度 | 分装 | 价格（CNY） | 周期 |
| 超纯化AAV病毒⼩量制备 | >5 x 1013 GC | >5 x 1013 GC/ml | 10 x 100 ul | ￥39,200.00 | 42-56天 |
| 超纯化AAV病毒中量制备 | >2.5 x 1014 GC | >5 x 1013 GC/ml | 25 x 200 ul | ￥141,400.00 | 49-63天 |
| 超纯化AAV病毒⼤量制备 | >5 x 1014 GC | >5 x 1013 GC/ml | 50 x 200 ul | ￥267,200.00 | 57-70天 |
注意：Baculovirus-based approach生产的AAV只可应用于以下的AAV血清型：1、2、5、6、8、9。
病毒类型
我们提供的AAV类型
- 单链AAV（Single-stranded AAV，ssAAV）和自互补AAV（Self-complementary AAV，scAAV）
- 18种血清型：1、 2、3、4、5、6、6.2、7、8、9、rh10、DJ、DJ/8、PHP.eB、PHP.S、AAV2-retro、AAV2-QuadYF和AAV2.7m8
- AAV空壳和类病毒颗粒（Virus-like particle，VLP)
我们提供的AAV的包装服务涵盖以下血清型：
按照血清型分类
按照组织嗜性分类
| 血清型 | 组织嗜性 |
| AAV1 | 平滑肌, 中枢神经系统, 肺, 视网膜, 内耳组织, 胰腺, 心脏, 肝 |
| AAV2 | 平滑肌, 中枢神经系统, 肝, 肾, 视网膜, 内耳组织 |
| AAV3 | 平滑肌, 肝, 肺 |
| AAV4 | 中枢神经系统, 视网膜, 肺, 肾 |
| AAV5 | 平滑肌, 中枢神经系统, 肺, 视网膜 |
| AAV6 | 平滑肌, 心脏, 肺, 脂肪组织, 肝 |
| AAV6.2 | 肺, 肝, 内耳组织 |
| AAV7 | 平滑肌, 视网膜, 中枢神经系统, 肝 |
| AAV8 | 平滑肌, 中枢神经系统, 视网膜, 内耳组织, 肝, 胰腺, 心脏, 肾, 脂肪组织 |
| AAV9 | 平滑肌, 肺, 肝, 心脏, 胰腺, 中枢神经系统, 视网膜, 内耳组织, 睾丸, 肾 |
| AAVrh10 | 平滑肌, 肺, 肝, 心脏, 胰腺, 中枢神经系统, 视网膜, 肾 |
| AAV-DJ | 肝, 心脏, 肾, 脾 |
| AAV-DJ/8 | 肝, 脑, 脾 |
| AAV-PHP.eB | 中枢神经系统 |
| AAV-PHP.S | 外周神经系统 |
| AAV2-retro | 脊神经 |
| AAV2-QuadYF | 内皮细胞 |
| AAV2.7m8 | 视网膜, 内耳组织 |
| 组织 | 推荐使用的AAV血清型 |
| 平滑肌 | AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 |
| 中枢神经系统 | AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-PHP.eB |
| 外周神经系统 | AAV-PHP.S |
| 脑 | AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV-DJ/8 |
| 视网膜 | AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV2.7m8 |
| 内耳组织 | AAV1, AAV2, AAV6.2, AAV8, AAV9, AAV2.7m8 |
| 肺 | AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV9, AAVrh10 |
| 肝 | AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| 胰腺 | AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10 |
| 心脏 | AAV1, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ |
| 肾 | AAV2, AAV4, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| 脂肪组织 | AAV6, AAV8, AAV9 |
| 睾丸 | AAV2, AAV9 |
| 脾 | AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| 脊神经 | AAV2-retro |
| 内皮细胞 | AAV2-QuadYF |
注意：携带目的基因的转移质粒上的ITR序列来自于AAV2。一般来说，包装不同血清型的AAV，指的是使用不同血清型的衣壳蛋白表达质粒，与携带AAV2 ITR的转移质粒进行包装。
查看不同腺相关病毒血清型病毒衣壳蛋白1（VP1）的氨基酸序列 >>
交付内容
ssAAV
scAAV
Baculovirus-Based Approach
| 非纯化ssAAV制备服务 | 纯化ssAAV制备服务 | |
| 交付内容 |
定制病毒，按照规格交付：
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定制病毒，按照规格交付：
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对照病毒，按照定制病毒的规格对应赠送：
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对照病毒，按照定制病毒的规格对应选购：
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辅助病毒，按照定制病毒的规格对应选购：
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辅助病毒，按照定制病毒的规格对应选购：
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|
| 病毒重悬液 | 50 mM Tris缓冲液（添加150 mM NaCl和5 mM MgCl2） | pH7.4 PBS缓冲液（添加200 mM NaCl和0.001% pluronic F-68） |
| 运输/存储 | 干冰/-80°C，避免反复冻融 | 干冰/-80°C，避免反复冻融 |
| 推荐应用 | 体外培养细胞转导 | 体外培养细胞转导、动物体内细胞转导 |
对照病毒
为了更好地开展您的实验，我们按照“对照病毒与定制病毒的生物学应用相匹配”的原则给您赠送或者推荐对照病毒。例如，如果定制病毒表达一个基因，则推荐的对照病毒表达荧光蛋白EGFP。如果定制病毒表达打靶某个基因的shRNA，则对照病毒表达一个Scramble shRNA。推荐的对照病毒信息如下表所示：
| 对照病毒 | 对照载体名称 | 对照载体ID | 定制病毒 |
| EGFP对照AAV病毒 | pAAV[Exp]-CMV>EGFP:WPRE | VB010000-9394npt | 哺乳动物基因表达AAV病毒（包含Tet-On诱导表达和FLEX条件性表达）、哺乳动物AAV CRISPR系统、哺乳动物非编码RNA表达AAV病毒 |
| mCherry对照AAV病毒 | pAAV[Exp]-CMV>mCherry | VB900129-0800rvh | |
| Scramble shRNA对照AAV病毒，EGFP荧光 | pAAV[shRNA]-EGFP-U6>Scramble_shRNA | VB010000-0023jze | 哺乳动物shRNA干扰AAV病毒 |
| Scramble shRNA对照AAV病毒，mCherry荧光 | pAAV[shRNA]-CMV>mCherry-U6>Scramble_shRNA | VB010000-0024wah | |
| Scramble miR30-shRNA对照AAV病毒，EGFP荧光 | pAAV[miR30]-CMV>EGFP:Scramble_miR30-shRNA:WPRE | VB010000-9397wgw | 哺乳动物miR30-shRNA干扰AAV病毒 |
| Tet-On EGFP 对照AAV病毒（选购） | pAAV[Tet_on]-TRE>EGFP-CBh>tTS:T2A:rtTA | VB010000-0053bwh | 哺乳动物基因Tet-On诱导表达AAV病毒 |
| FLEX-EGFP对照AAV病毒（选购） | pAAV[FLEX_on]-CMV>rev(EGFP) | VB180820-1044gcq | 哺乳动物基因FLEX条件性表达AAV病毒 |
辅助病毒
为了更好地开展您的实验，我们按照“辅助病毒与定制病毒的生物学应用相匹配”的原则给您推荐辅助病毒。例如，如果定制病毒是一个只含TRE启动子的TetOn慢病毒，则需要一个表达rtTA的辅助病毒，才能进行诱导表达实验。推荐的辅助病毒信息如下表所示：
| 辅助病毒 | 辅助载体名称 | 辅助载体ID | 定制病毒 |
| SaCas9 AAV病毒（选购） | pAAV[Exp]-CMV>saCas9 | VB180125-1089ffa | 哺乳动物gRNA AAV病毒（不含Cas9） |
| Cre AAV病毒（选购） | pAAV[Exp]-CMV>Cre | VB171024-1202yau | 哺乳动物基因FLEX条件性表达AAV病毒 |
| 非纯化scAAV制备服务 | 纯化scAAV制备服务 | |
| 交付内容 |
定制病毒，按照规格交付：
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定制病毒，按照规格交付：
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对照病毒，按照定制病毒的规格对应赠送：
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对照病毒，按照定制病毒的规格对应选购：
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辅助病毒，按照定制病毒的规格对应选购：
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辅助病毒，按照定制病毒的规格对应选购：
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| 病毒重悬液 | 50 mM Tris缓冲液（添加150 mM NaCl和5 mM MgCl2） | pH7.4 PBS缓冲液（添加200 mM NaCl和0.001% pluronic F-68） |
| 运输/存储 | 干冰/-80°C，避免反复冻融 | 干冰/-80°C，避免反复冻融 |
| 推荐应用 | 体外培养细胞转导 | 体外培养细胞转导、动物体内细胞转导 |
对照病毒
为了更好地开展您的实验，我们按照“对照病毒与定制病毒的生物学应用相匹配”的原则给您赠送或者推荐对照病毒。例如，如果定制病毒表达一个基因，则推荐的对照病毒表达荧光蛋白EGFP。如果定制病毒表达打靶某个基因的shRNA，则对照病毒表达一个Scramble shRNA。推荐的对照病毒信息如下表所示：
| 对照病毒 | 对照载体名称 | 对照载体ID | 定制病毒 |
| EGFP对照scAAV病毒 | pscAAV[Exp]-CMV>EGFP:WPRE | VB010000-9304aud | 哺乳动物基因表达scAAV病毒 |
| Scramble shRNA对照scAAV病毒，EGFP荧光 | pscAAV[shRNA]-EGFP-U6>Scramble_shRNA | VB010000-9343nhh | 哺乳动物shRNA干扰scAAV病毒 |
| 纯化AAV制备服务（通过杆状病毒转导Sf9昆虫细胞制备） | |
| 交付内容 |
定制病毒，按照规格交付：
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对照病毒，按照定制病毒的规格对应选购：
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| 病毒重悬液 | pH7.4 PBS缓冲液（添加200 mM NaCl和0.001% pluronic F-68） |
| 运输/存储 | 干冰/-80°C，避免反复冻融 |
| 推荐应用 | 体外培养细胞转导、动物体内细胞转导 |
对照病毒
为了更好地开展您的实验，我们按照“对照病毒与定制病毒的生物学应用相匹配”的原则给您赠送或者推荐对照病毒。例如，如果定制病毒表达一个基因，则推荐的对照病毒表达荧光蛋白EGFP。如果定制病毒表达打靶某个基因的shRNA，则对照病毒表达一个Scramble shRNA。推荐的对照病毒信息如下表所示：
| 对照病毒 | 对照载体名称 | 对照载体ID | 定制病毒 |
| 超纯化EGFP对照AAV病毒，杆状病毒感染Sf9方法 | pBV-ITR-CMV>EGFP-ITR | VB010000-9306ded | 哺乳动物基因表达AAV病毒（通过杆状病毒转导Sf9昆虫细胞制备） |
运输/储存
我们的AAV病毒存储在特殊的Tris缓冲液或PBS缓冲液中，并采用干冰运输。收到AAV病毒后，立即放置于-80℃，可保存约一年。若放置于-20℃，则可保存2-3周。融解后的AAV病毒可在4℃保存1-2周。虽然AAV病毒比其他多数病毒稳定（如慢病毒），但是也请避免反复冻融，因为这会导致AAV病毒滴度显著下降。
生产/质控
三质粒转染法生产AAV
使用杆状病毒生产AAV
| 步骤 | 描述 | 时间 |
|
Triple-transfection |
我们常规使用的helper-free腺相关病毒包装系统包括1个转移质粒（Transfer plasmid）、1个Rep和Cap表达质粒（Rep-Cap plasmid）和1个辅助质粒（Helper plasmid），其包装过程是将携带目的基因（Gene of Interest， 简称GOI）和ITR序列的转移质粒、表达特定血清型衣壳蛋白的Rep-Cap质粒和编码介导腺相关病毒复制的腺病毒基因（E2、E2A和VA）的辅助质粒共转染HEK293T包装细胞，这个转染过程称为三质粒转染（Triple-transfection）。 | 第1天 |
|
Supernatant collection |
在细胞里，转导质粒表达包含目的基因（Gene of Interest, GOI）的AAV基因组，Rep-Cap质粒表达特定血清型的AAV衣壳蛋白，辅助质粒表达辅助AAV基因组表达翻译的组分。三者共同作用从而在细胞中生成完整的AAV病毒颗粒。细胞短暂孵育后，根据血清型的不同，收集上清或者细胞裂解液获取病毒颗粒 | 第3天 |
|
Concentration and purification |
PEG浓缩病毒颗粒。对于超纯化腺相关病毒（体内应用级别），再通过氯化铯（CsCl）密度梯度离心对病毒颗粒进一步纯化和浓缩。 | 第5天 |
|
Quality Control |
对病毒采用ITR qPCR方法进行滴度测定（Titer determination）、并且还进行微生物检测（Bioburden test，针对细菌、真菌）、支原体检测（Mycoplasma test）等。 若转移载体同时编码一个荧光蛋白，我们还会将病毒进行细胞转导以测定相应的荧光表达情况（Transduction test）。此外，对于超纯化AAV病毒，我们还可以检测内毒素水平（Endotoxin test）和使用SDS-PAGE方法检测病毒纯度（Virus purity test）。 |
第7天及以后 |
我们的使用杆状病毒包装AAV的工作流程包括两个主要步骤，如图1所示。步骤1中产生两种重组杆状病毒，第一个表达目的基因（GOI），其两侧有AAV反向末端重复序列 (Inverted terminal repeat，ITR)，第二个则是辅助杆状病毒表达AAV rep和cap基因。在步骤2中，通过将步骤1产生的两种重组杆状病毒共同感染昆虫细胞来产生重组AAV颗粒。
为产生两种重组杆状病毒（一种表达GOI，其两侧是AAV ITR；另一种表达AAV rep/cap基因），首先需要将每种杆状病毒的表达盒克隆至杆状病毒转移载体中。然后将杆状病毒转移载体与表达Tn7转座酶的辅助质粒共转化至含有杆状病毒穿梭空载体（又名杆粒）的细菌宿主中，以产生重组杆粒。然后将重组杆粒转染到昆虫Sf9细胞中。经过短暂的孵育期，从培养基中收集病毒颗粒并使用蔗糖梯度密度离心进一步浓缩。我们采用qPCR测定杆状病毒滴度。然后将两种重组杆状病毒共感染昆虫细胞中。在72-96 小时的孵育期后，从细胞裂解液和上清液中收集AAV颗粒，并通过PEG沉淀法进行浓缩。对于超纯化 AAV（体内应用级别），AAV病毒颗粒通过氯化铯 (CsCl) 梯度超速离心进一步纯化和浓缩。我们使用qPCR测定AAV滴度。
图1 Baculovirus-AAV的典型生产流程
对于每个我们生产的AAV，我们的QC包括qPCR滴度测定（Titer measurement）、微生物检测（Bioburden test，针对细菌、真菌）、支原体检测（Mycoplasma test）等。若转移载体同时编码一个荧光蛋白，我们还会将病毒进行细胞转导以测定相应的荧光表达情况（Transduction test）。此外，对于超纯化AAV病毒，我们还可以检测内毒素水平（Endotoxin test）和使用SDS-PAGE方法检测病毒纯度（Virus purity test）。
试验验证
我们开发了一系列专有技术用于优化我们的Baculovirus-AAV包装流程。因此我们的病毒在转导哺乳动物细胞时表现出良好的转导效率。
图2 表达EGFP的Baculovirus-AAV转导HEK293T细胞，血清型为AAV1和2，MOI 10000。左：明场。右：EGFP。
滴度保证
我们的滴度保证仅适用于包装进病毒的区域（从5’ ITR到3’ ITR）小于腺相关病毒承载限度（4.7 kb，～野生型AAV2基因组长度）的载体。超过该范围，超出4.7 kb的那部分序列在包入衣壳时会被剪切掉，导致包装出来的AAV病毒颗粒含有不完整的基因组，不仅影响ITR qPCR滴度检测，而且影响转基因表达。此外，对于如下情况，我们同样不能保证滴度：
- AAV血清型3、4、6、6.2、2.7m8的滴度通常偏低。对于这些血清型我们保证其滴度是其它血清型最小滴度的50%。
- 包含对包装过程有不利影响的序列，例如毒性基因（如促凋亡基因）；破坏包装细胞或病毒的完整性（如导致细胞聚集的膜蛋白）的基因 ；易于重排或者产生二级结构的序列（如重复序列或者高GC含量序列）。
- ⽤户提供的载体，因为我们无法控制载体质量。
客户提供载体
如需客户提供AAV病毒载体，则请按照外来物品接收指南将载体寄送给我们。请严格按照我们的指南来进行装运以免造成物品的任何延误和损坏。客户提供的所有材料均需经过QC检测，每一份材料附加检测费用。请注意，客户提供物品接收并通过QC之后生产才正式开始。
试验验证
我们开发了一系列专有技术用以优化三质粒转染法包装AAV的效率。我们的病毒经过验证，在哺乳动物细胞中表现出很高的转导效率。
图1 向HEK293T细胞转导18种血清型的重组AAV病毒，这些AAV病毒均使用CMV>EGFP载体（VB010000-9394npt）。转导后48小时的EGFP表达效果如下图所示。比例尺：100 um。
图2 向HeLa细胞转导18种血清型的重组AAV病毒，这些AAV病毒均使用CMV>EGFP载体（VB010000-9394npt）。转导后48小时，EGFP的（A）荧光强度中值（MFI）和（B）细胞阳性率通过流式细胞术检测。（C）不同血清型AAV的EGFP表达效果如下图所示。比例尺：100 um。
图3 向Huh-7细胞转导18种血清型的重组AAV病毒，这些AAV病毒均使用CMV>EGFP载体(VB010000-9394npt）。转导后48小时，EGFP的（A）荧光强度中值（MFI）和（B）细胞阳性率通过流式细胞术检测。（C）不同血清型AAV的EGFP表达效果如下图所示。比例尺：100 um。
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常见问题解答
| 慢病毒 | MMLV | 腺病毒 | AAV | |
| 组织嗜性 | 广泛 | 广泛 | hAd5只感染表达CAR受体的细胞 | 取决于血清型 |
| 是否可感染非分裂细胞 | 是 | 否 | 是 | 是 |
| 病毒基因组稳定整合抑或游离于宿主基因组 | 稳定整合 | 稳定整合 | 游离的DNA附加体形式 | 游离的DNA附加体形式 |
| 滴度 | 高 | 中等 | 非常高 | 高 |
| 自定义启动子 | 是 | 否 | 是 | 是 |
| 应用 | 细胞培养和体内实验 | 细胞培养和体内实验 | 体内实验 | 体内实验 |
| 体内免疫反应 | 低 | 低 | 高 | 非常低 |
我们通过裂解AAV病毒颗粒，然后以qPCR测定裂解产物中的AAV基因组拷贝数（ITR区域的拷贝数）来获取AAV的物理滴度（Physical titer）。其他滴度测定方式如ddPCR、TCID50以选购方式提供。