进一步了解 >> 我们的质量体系通过ISO 9001认证。这些产品是在我们先进的设施中严格控制下生成的。

shRNA基因敲低解决方案

云舟生物提供全面的shRNA基因敲低解决方案,帮助您获得高效的RNAi效果。我们提供基于U6启动子驱动的shRNA的和自定义启动子驱动的miR30 shRNA的两种shRNA表达方式,根据您的实验需求可灵活控制shRNA的表达。我们可以对shRNA载体进行多种类型多种滴度的病毒包装(如慢病毒、AAV、腺病毒),以帮助您将shRNA递送至难以转染的细胞中。我们还可以专门为哺乳动物细胞中的大规模基因功能丧失筛选构建shRNA文库。此外,我们的线载体设计平台与shRNA 数据库涵盖了多种物种,让您轻松找到合适的shRNA打靶您的目的基因。

亮点

  • 高度直观的载体在线设计平台,搭载全基因组shRNA数据库,方便快捷地进行shRNA载体设计
  • 丰富的载体骨架和载体元件
  • 可提供预制的或定制的shRNA文库
  • 序列100%验证,周期短、性价比高
  • 专业的技术支持为您解决shRNA的选择、载体设计、实验难点等问题
订购信息

定制shRNA载体

使用我们高度直观的线上载体设计平台,你可以选择超过30种包括病毒类型与非病毒的shRNA载体骨架,并且可以自由组合启动子、报告基因、药筛标记等载体元件。我们的shRNA数据库可帮助您方便地选择打靶目的基因的shRNA,同时无需您自行设计序列。我们还同时提供shRNA打靶效率检测载体,以让您可以测试您的shRNA的干扰效率。 对于我们的shRNA载体,您均可购买额外的下游服务,如质粒DNA制备和病毒包装服务。

除去以上的列表中的载体系统,我们还可以提供Cre-lox条件表达shRNA载体。请发送设计咨询给我们。

常用shRNA载体

云舟生物提供一系列常用shRNA载体,可表达scramble shRNA或照载体上的常见基因的shRNA。在将这些载体加入购物车之后,您还可以购买质粒DNA提取和病毒包装等下游服务。 您可以使用下方的载体工具栏订购您的U6 shRNA载体。

如果您需要订购miR30 shRNA载体,请向我们发送设计咨询

shRNA病毒包装

我们提供多种规格的的优质的慢病毒、AAV 和腺病毒包装服务,可以将shRNA递送只难转染的细胞中。我们拥有专有的技术和试剂,大大改进了病毒包装的滴度、纯度、活性和一致性,还可以针对病毒包装时的所使用的病毒载体进行优化。

点击了解慢病毒包装服务 

点击了解AAV病毒包装服务 

点击了解腺病毒包装服务 

点击了解更多类型的病毒包装 

shRNA(3+1)病毒套装

需要注意的是,并非所有经验设计的shRNA均会有良好的干扰效果。shRNA的干扰效果取决于多个因素,包括shRNA的长度、茎环结构、GC含量、shRNA的热力学稳定性、靶序列的二级结构、对于其它基因的脱靶效应等。一般来说,约50%~70·%的shRNA具有可见的干扰效果,而其中的20-30%具有强的干扰效果。因此,选择多个shRNA用于打靶有助于发现敲低效率最高的shRNA。

云舟生物提供的shRNA(3+1)病毒套装包含3个针对你的目的基因的定制shRNA病毒,以及一个可用于测试多个shRNA的高性价比的scramble对照病毒。我们目前提供慢病毒、AAV以及腺病毒的shRNA(3+1)病毒套装。

点击查看shRNA(3+1)病毒套装详情 

您可以使用下方的工具栏订购shRNA(3+1)套装。

请注意改工具栏只适用于设计U6 shRNA载体。如果您需要设计miR30-shRNA载体,或者无法找到您的打靶基因,请发送设计咨询给我们。

shRNA文库

shRNA文库在研究疾病通路、药物治疗中的细胞反应、发育过程、基因调控方面,是进行大规模基因功能丧失筛选的强大且高性价比的工具。根据您的需要,我们可以把构建的文库转化大肠杆菌,也可以以DNA或病毒的形式给您发货。我们定制的文库都会进行NGS测序验证以确定文库的质量。

点击此处查看我们的shRNA定制文库详情 

我们提供高质量的针对人和小鼠基因的shRNA慢病毒文库产品。对于每个物种,我们提供了两种规格的慢病毒shRNA文库产品:全基因组大库(针对约19,000个RefSeq基因)和精华基因小库(针对PubMed Central上约2,000个最常被引用的基因),每个基因对应5-6个不同的shRNA。我们的shRNA文库已通过了NGS测序和功能验证。

点击此处查看我们的预制shRNA文库详情 

预制shRNA文库的亮点

  • 全基因组高覆盖度打靶
  • NGS验证文库质量
  • 高均一性
  • 预制的高滴度慢病毒
  • 双标记基因,可高效且灵活地筛选转导后的细胞
产品名称 基因数量(个) shRNA数量(条) 规格* 货号 价格(CNY)
人类精华基因shRNA文库 2,161 12,471

标准规格

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

LVM(Lib190505-1037bjk) ¥19,500
¥39,000
小鼠精华基因shRNA文库 2,233 12,472

标准规格

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

LVM(Lib190505-1039sgb) ¥19,500
¥39,000
人类全基因组shRNA文库 18,432 92,917

标准规格

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

LVM(Lib190505-1038ngq) ¥19,500
¥39,000

大规格

(>1.0x108 TU/ml, 5 ml)

LV5M(Lib190505-1038ngq) ¥60,000
¥120,000
小鼠全基因组shRNA文库 19,790 92,917

标准规格

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

LVM(Lib190505-1042tfx) ¥19,500
¥39,000

大规格

(>1.0x108 TU/ml, 5 ml)

LV5M(Lib190505-1042tfx) ¥60,000
¥120,000

* 对于精华基因文库,标准规格包装的慢病毒可以满足>40次筛选的要求,且达到100x的覆盖率。对于全基因组文库,标准规格包装的慢病毒可以满足>5次筛选的要求,且达到100x的覆盖率;大规格包装的慢病毒可以满足>25次筛选的要求,且达到100x的覆盖率。

shRNA基因敲低细胞稳转株

云舟可为您提供长期敲低目的基因的需求定制构建shRNA敲低细胞稳转株。我们基于shRNA分值测试三个候选的shRNA,然后将最佳敲低效率的一个通过慢病毒转导生产细胞稳转株。我们通过RT-PCR验证细胞中的基因敲低水平。此外,我们还会进行一系列标准的QC检测,如无菌检测、支原体检测,然后才会放行最终的细胞产品。

细胞模型 构建方式 交付内容 价格 周期
shRNA基因敲低稳转株构建 慢病毒转导 多克隆细胞群 ¥22,980.00起 8-14周
3个单克隆细胞株 ¥29,980.00起 12-21周

点击此处查看我们更多的细胞稳转株服务 

技术详情

短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)是具有茎环结构的RNA分子,可用于通过互补碱基配对靶向mRNA序列并促使其降解,因此广泛用于各种RNAi应用。通常可以使用双链DNA载体以病毒和非病毒形式将shRNA引入靶细胞。当用shRNA载体转染或转导细胞时,shRNA在细胞核中转录形成发夹结构。shRNA发夹结构包含一个茎环,一条RNA反义链和与其互补的正义链。转录形成的shRNA离开细胞核,在细胞质中经过Dicer加工,然后加载到RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)复合体上,随后目标mRNA被识别并降解(图1)。

图1 U6 shRNA和miR-shRNA介导的基因敲低

shRNA相对于siRNA具有显著的在基因敲低效率上的有时,因此成为流行的RNAi方式。下表总结了两者的具体的特点:

shRNA基因敲低 siRNA基因敲低
递送方法 根据载体类型进行转染或者转导 转染
敲低时长 长期 瞬时
游离体抑或稳定整合 根据不同的递送方式,可具有游离体或者稳定整合的形式 游离体
添加筛选标记 可添加荧光或者药物筛选标记
适用细胞类型 适用于相当广泛的细胞类型 只适合易转染细胞
脱靶效应
自身降解速度

控制shRNA表达

有两种常用方法来控制载体上的shRNA表达:基于U6启动子的shRNA 表达和基于miR的shRNA表达。虽然基于U6的shRNA载体使用 RNA聚合酶III启动子驱动简单茎环 shRNA 的表达,基于miR的shRNA 载体则使用RNA聚合酶II启动子表达适配microRNA支架的 shRNA。这两种shRNA在细胞质内通过相似的机制被加工,最后导致靶基因沉默。然而,在细胞核内转录后,基于miR的shRNA与基于U6的shRNA不同,由于其结构内存在miR内源序列,其加工方式更像初级miRNA(图1)。

miR shRNA载体中的RNA聚合酶II启动子包含了组织特异性、可诱导的或可变强度等启动子等类型,从而使其可应用于组成型U6启动子无法应用的各种实验场景。相对于其它的基因敲低载体系统,RNA聚合酶II启动子在基于miRNA的shRNA系统中可有效转录长转录本,因此该系统具有几个额外优势。比如说,可以多个shRNAmiR可以转录为单个多顺反子,且在细胞内可加工形成成熟的shRNA。这允许使用单个转录本敲低多个基因或靶向同一基因的多个区域。因此,该载体可用于表达单个或多个shRNAmiR。其次,在该载体系统中,用户选择的蛋白质编码基因可以放在shRNAmiRs的多顺反子中。此ORF的表达可用于直接监测shRNA转录(如果使用标记基因ORF)或用于需要ORF和shRNA共表达的其他情景。

虽然miR shRNA载体在控制shRNA表达上更为灵活,我们发现U6 shRNA载体相对miR shRNA载体的敲低效果的鲁棒性更佳。因此除非必须使用miR shRNA载体,通过我们会推荐首先使用U6 shRNA载体用于RNAi实验。

下表比较了U6 shRNA载体与miR shRNA载体的特点:

U6 shRNA载体 miR shRNA载体
shRNA结构 简单的茎环shRNA shRNA 适配一个microRNA 骨架
shRNA长度 50-70 nt >250 nt
启动子 RNA聚合酶III启动子,如 U6和H1 RNA聚合酶II启动子,如广泛性启动子和组织特异性启动子
shRNA加工机制 只在细胞质中经过Dicer加工 在细胞核内经过Drosha加工,在细胞质中通过Dicer加工
一个载体上可表达的shRNA数量 通常为单shRNA 单个或多个shRNA
是否可以在shRNA转录本上表达其它ORF
基因敲低效率 鲁棒性较高 鲁棒性较低
毒性 高细胞毒性 较低的细胞毒性

试验验证

我们的U6 shRNA慢病毒载体经过基因敲低效率验证,结果如下图所示。结果展现了U6 shRNA与miR30 shRNA之间的敲低效率比较。

图2 U6 shRNA慢病毒载体与miR30 shRNA慢病毒载体对EGFP的敲低效率比较。(A)U6启动子驱动的shRNA表达的慢病毒载体与miR30 shRNA(4条shRNA)慢病毒载体分别包装成慢病毒,然后转导稳定表达EGFP的HEK293T细胞。药筛前后流式细胞术检测EGFP表达情况。(B)药筛前,EGFP表达在U6 shRNA的作用下减少了46%(P<0.001),在CMV启动子驱动表达的miR30 shRNA(单shRNA)作用下减少了13%(P<0.001),在CMV启动子驱动表达的miR30 shRNA(4条shRNA)作用下减少了44%(P<0.001)。(C)EGFP表达在U6 shRNA的作用下减少了72%(P<0.001),在CMV启动子驱动表达的miR30 shRNA(单shRNA)作用下减少了60%(P<0.001),在CMV启动子驱动表达的miR30 shRNA(4条shRNA)作用下减少了67%(P<0.001)。EGFP的相对表达量通过转导与未转导细胞的荧光强度中值(Median fluorescence intensities,MFI)的比值计算。三次重复实验,图中显示SD值,p值根据Tukey检验计算。

shRNA数据库

云舟生物的在线shRNA载体设计工具专门为多个物种的shRNA设计进行了优化,可帮助您针对靶基因设计出高干扰效率的shRNA序列。我们设计和评估shRNA的规则与RNAi consortium(TRC)使用的规则类似。所有的干扰分值均≥0,平均数约为5,标准差约为5,95%的分值均≤15。若一个shRNA的干扰分值是15,则表示具有很高干扰效率且易于克隆;若干扰分值为0,则表示干扰效果较差或难以克隆。

当您在我们的在线平台上设计shRNA载体时,您可以选择在我们的数据库中搜索您的目的基因。输入您的基因名称后,您将在我们的数据库中看到针对您的目的基因的所有shRNA的详细信息,包括指向UCSC数据库的链接,从而可查看其基因组序列和所有转录本。我们的数据库按照针对目的基因的shRNA的干扰分值对shRNA进行排序,并推举出三个干扰分值最高的shRNA。请注意干扰分值只是一个参考值。实际的干扰效果可能会与预测的分值有偏差,低分值的shRNA也可能产生较好的干扰效果。同时,靶向转录本的 3’ UTR也可以起到干扰作用。 我们的网站包含丰富的学习资料,可帮助您安排并实施您的RNAi实验。

点击此处阅读shRNA载体系统指南 

点击此处查看定制shRNA载体所需要的载体元件指南 

参考文献

Mol Cell. 9:1327 (2002);Characterization of miR30-based gene knockdown.

Nucleic Acids Res. 34:e53 (2006); Development of miR155-based shRNA vectors.

J Gene Med. 9:620 (2007); Development of IPTG-inducible gene knockdown system.

Proc Natl Acad Sci USA. 101:10380 (2004);Development of Cre-lox-regulated gene knockdown system.

文档

暂无

常见问题解答

无论是shRNA介导的基因敲低抑或是gRNA介导的基因敲除(如CRISPR或TALEN)都可能是研究基因功能丧失的富有价值的实验方法。为了确定哪种方法最适合您的实验应用,以下是您应该考虑的一些事项。

基本原理

基因敲低载体

基因敲低载体表达shRNA抑制靶基因的mRNA,通过引发mRNA的切割抑制翻译过程。shRNA敲低不改变靶基因的DNA序列。

点击此处了解更多关于shRNA载体的信息 

基因敲除载体

CRISPR和TALEN都是通过指导核酸酶切割基因组中的特定靶位点来发挥作用。然后这些切割位点被细胞低效地修复,从而导致修复部位的永久性突变,比如产生基因的小片段插入或碱基缺失。这类突变的一部分会导致基因的阅读框移码、出现提前终止密码子等,最终导致目的基因的功能丧失。如果同时靶向基因组中两个相邻紧密的切割位点(距离几个kb),也可以导致其间区域的删除。

点击此处了解更多关于CRISPR载体的信息 

效率

shRNA敲低永远不会完全抑制靶基因的表达。即使对于最有效的shRNA,靶基因的一些残留表达也会保留。相比之下,在一小部分经过处理的细胞群中,CRISPR和TALEN可以产生永久性突变,这可能导致基因功能完全丧失。

一致性和均一性

shRNA载体通常在转染/转导的细胞时获得较好的均一性,实验之间的一致性也较佳。相比之下,由于引入突变是随机的,CRISPR和TALEN的基因编辑效果在细胞之间的差异相当大。为了完全敲除细胞中的目的基因,必须敲除细胞中基因的所有拷贝。鉴于正常细胞具有任何基因的两个拷贝(X或Y连锁基因除外),而癌细胞可以具有两个以上的拷贝,这种完全敲除的细胞可能只占所有处理后的细胞的一小部分。出于这个原因,核酸酶介导的敲除实验需要通过测序来筛选克隆,以确定所有目的基因拷贝都被敲除的子细胞群。

脱靶效应

已有报道表明shRNA介导的基因敲低和核酸酶介导的基因敲除均会产生脱靶效应。脱靶效应的表征可以通过使用多个不同的shRNA 靶向同一基因来评估。如果一个基因被在多个不同的shRNA作用下仍然表现出一致的表征,则这种表征通常则不是脱靶效应带来的。对于CRISPR或TALEN基因敲除,应分析含有功能丧失突变的多个克隆,以包含可能由脱靶突变引起的任何表征。此外,可以对克隆进行脱靶位点测序,通过生物信息学方法鉴定以查看它们是否已发生突变。

点击此处开始线上设计同源重组供体载体 

并不是所有的shRNA都会起作用

根据我们的经验和来自客户的反馈,使用3-4个shRNA进行干扰测试时,通常只有2-3个有比较合理的干扰效果。所以,在使用shRNA时,重要的是要认识到并非所有的shRNA都能正常工作。通常情况下,约50-70%的shRNA具有干扰效果,其中只有约20-30%的shRNA具有比较明显的效果。如果您使用几个shRNA靶向同一个基因都没有一个能产生满意的干扰效果,最好的解决方式是尝试更多的shRNA,特别是那些经过文献验证的shRNA。目前,许多研究人员使用靶向相同基因的shRNA库(即不同shRNA的混合物)进行实验,以期提高干扰效率。

干扰效率检测方法不当

最常用评估shRNA干扰效率的灵敏测定方法是RT-qPCR,您可能需要尝试几对引物,筛选出最具特异性和效率的引物对。通常情况下,RT-qPCR引物应跨越内含子,即设计在两个外显子上,以免扩增基因组DNA。当使用新引物时,建议您先进行预扩增实验,并将PCR产物进行电泳检测目的条带,或者甚至可以通过测序验证PCR产物是否正确。在进行RT-qPCR的同时,应注意设置minus-RT对照以评估基因组DNA的污染水平。您可以使用NCBI引物设计工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)来检查引物质量。 干扰效率也可以通过蛋白质印迹法(Western blot)进行评估。然而,该方法常产生来自非特异性抗体结合的假阳性条带,从而导致误判没有干扰效果。因此,在使用时需要确保抗体的特异性。 您使用的shRNA可能只打靶基因的某个转录本 在设计shRNA时,我们推荐您使用那些能靶向单个基因多个转录本的shRNA,除非您只想打靶特定转录本。VectorBuilder提供针对常见物种的shRNA数据库。当您将shRNA元件插入载体时,您可以选择shRNA数据库,通过搜索目的基因查看所有可用的shRNA详细信息。您还可以打开其中的UCSC链接,查看shRNA序列在基因组和转录本中位置等信息。

您使用的shRNA可能只打靶基因的某个转录本

在设计shRNA时,我们推荐您使用那些能靶向单个基因多个转录本的shRNA,除非您只想打靶特定转录本。VectorBuilder提供针对常见物种的shRNA数据库。当您将shRNA元件插入载体时,您可以选择shRNA数据库,通过搜索目的基因查看所有可用的shRNA详细信息。您还可以打开其中的UCSC链接,查看shRNA序列在基因组和转录本中位置等信息。

我们设计和评估shRNA的规则与RNAi consortium(TRC)使用的规则类似。对于每个RefSeq转录本,我们会搜索出所有的21 mers作为候选靶位点。以下因素会降低干扰效率/特异性或影响克隆,含有这些特点的序列将会被排除。主要因素包括:含有≥4个连续相同碱基,含有≥7个G或C,GC含量<25%或> 60%以及序列的5'端含有AA碱基。如果靶点内部含有茎环结构,或是3'末端的GC含量较高,或是该靶点是已知的miRNA核心序列或是会打靶到其他基因,则该靶点的分值就会较低。若靶位点存在于一个基因的多个转录本,则该靶点的分值就会较高。 所有的干扰分值均≥0,平均数约为5,标准差约为5,95%的分值均≤15。若一个shRNA的干扰分值是15,则表示具有很高干扰效率且易于克隆;若干扰分值为0,则表示干扰效果较差或难以克隆。