进一步了解 >> 我们的质量体系通过ISO 9001认证。这些产品是在我们先进的设施中严格控制下生成的。

mRNA体外转录合成

传统方式在靶细胞中表达外源基因通常需要引入含有外源DNA片段的病毒载体或非病毒载体,但是对于临床应用,通过以上方式在人体中直接引入外源DNA存在显然的安全性问题。相较之下,人工合成的mRNA由于其无感染能力、不整合基因组以及细胞内可自然降解的特点,在安全性上具有天然的优势,因此也是用于基因治疗和新型疫苗研究的热门工具。

我们合成的mRNA利用体外转录方式制备,长度可达10 kb以上。经过核苷修饰、转录后修饰及柱纯化等一系列特定工艺流程,我们的mRNA分子可针对于不同的下游场景进行优化定制,如细胞转染、胚胎注射、生物药和疫苗研制等。其它类型的小RNA分子,如CRISPR/Cas9系统中的gRNA,也可以根据给定的序列进行合成。

我们提供的体外转录RNA类型

  • 长度>10 kb的mRNA
  • 用于CRISPR实验的gRNA
  • 小RNA分子,如siRNA、microRNA等
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订购信息
生产规格 应用 交付内容 分装 价格(CNY) 周期
200 ug-1 mg 分子生物学实验、细胞转染、体内实验 定制mRNA,>500 ng/ul,保存于柠檬酸钠缓冲液或无酶水,无菌 1 vial 请咨询 根据项目进行评估 订购咨询
>1 mg 根据实际产量分装 请咨询 订购咨询

以上报价不包含体外转录载体构建费用。

对于mRNA合成服务,我们默认为mRNA分子添加5’ m7G帽子和3’ polyA尾巴。增加修饰将收取额外费用。

根据mRNA制备工艺的差异我们将使用特定的RNA保存溶液

以上mRNA浓度范围是通过使用我们提供的UTR序列测试所得。若客户要求使用自身提供的UTR序列制备mRNA,我们需要对其翻译效率进行评估,其mRNA产量以实际所得为准。

mRNA类型
  • 普通无修饰的mRNA
  • 5’帽子进一步修饰的mRNA,比如使用Cap 1帽子
  • 核苷修饰的mRNA,比如使用1-甲基假尿苷(1-Methylpseudouridine)替代尿苷
特点
  • 使用来源于噬菌体的T7 RNA聚合酶进行体外转录,可高效合成10 kb以上长度的mRNA分子
  • 为mRNA分子添加5’ m7G帽子和3’ polyA尾巴,增强mRNA的稳定性和翻译效率
  • 根据物种进行密码子优化,增强mRNA翻译效率
  • 提供多样的mRNA修饰,如添加核苷修饰以调节固有免疫应答
  • 转录产物经过DNase和磷酸酶处理,去除残留DNA模板和mRNA 5’磷酸基团
  • 从硅胶柱纯化到磁珠纯化的多种RNA纯化方法可供选择
载体图谱
生产/质控

我们使用体外转录方法制备mRNA,该方法使用了位于目的基因DNA模板序列上游的T7启动子,并且在适当的反应条件和ATP存在下,通过噬菌体T7 RNAP作用高效转录出mRNA分子。T7 RNAP是一种强大的酶,使用这种酶的转录反应可以在几个小时内产生大量的有功能的RNA。我们典型的mRNA 生产流程是从模板DNA序列的设计和合成开始,然后将其克隆到体外转录载体中。然后对质粒DNA进行纯化、验证和线性化,然后进行体外转录反应,从而产生所需的转录本。然后通过硅胶柱子纯化mRNA,这是我们默认的纯化过程。我们还可以根据要求使用磁珠来纯化mRNA。

图1 体外转录mRNA生产的典型流程

云舟生物生产的mRNA产品经过严格的质量检验以保证其不含污染物并且序列与设计时保持一致。根据服务方案的不同,我们的质检方法可包括:1、酶切鉴定与Sanger测序确保体外转录使用的DNA载体序列正确。2、PAGE琼脂糖凝胶电泳检测RNA转录本大小。3、内毒素、无菌检测。4、RNA测序。5、浓度、纯度鉴定等。

实验验证

我们的体外转录mRNA经过专门优化,加强了稳定性并有助蛋白高效翻译。下图为使用我们设计的EGFP mRNA体外成功转染HEK293T细胞以及纯化后的mRNA电泳的案例:

图1 Cap 1帽子修饰的EGFP mRNA转染HEK293T细胞。转染后48小时进行拍摄。放大倍数:100x。左:明场。右:荧光。

图2 纯化后的Cap 1帽子修饰的EGFP mRNA的1.2%变性琼脂糖胶电泳。泳道1:1 ug mRNA, 保存于无酶水。泳道2:1 ug mRNA,保存于1 mM柠檬酸钠缓冲液。泳道3:1.5 ug mRNA,保存于无酶水。泳道4:1.5 ug mRNA,保存于1 mM柠檬酸钠缓冲液。L:RNA Ladder。电泳条件:200 V, 200 mA, 15 min。

图3 使用1 ug核苷修饰的表达荧光素酶报告基因的Cap1 mRNA转染HEK293T细胞(1.6x105 cells/well),转染后24小时和48小时分别进行荧光素酶活性检测。RLU:Relative light unit。Unmodified:无核苷修饰的mRNA。m1ψ:1-甲基假尿苷修饰的mRNA。m5C:5-甲基胞苷修饰的mRNA。

运输/储存

我们的mRNA保存于无酶水中并通过干冰形式运输。接收到货物后,请将mRNA放置于-80℃长期保存(可稳定保存至少6个月),或者放置于-20℃保存一周。mRNA的保质期为1年。请勿反复冻融mRNA,否则将导致其显著降解。

客户提供载体

如果客户提供体外转录载体,则请按照外来物品接收指南将载体寄送给我们。请严格按照我们的指南来进行装运以免造成物品的任何延误和损坏。客户提供的所有材料均需经过QC检测,每一份材料附加检测费用。请注意,客户提供物品接收并通过QC之后生产才正式开始。

视频

暂无

文档

使用说明书

体外转录的RNA

COA

您可以在我们的产品标签或包装上找到产品批号。

常见问题解答

使用体外转录法制备mRNA相较化学法合成具有以下几点优势:

1. 高性价比:化学法合成RNA通常为固相载体上合成寡核苷酸,利用亚磷酰胺法进行反应。该方法包含较多技术步骤,整体流程复杂且成本较高。体外转录法则可以方便地合成多种类型的RNA分子,并且技术简单、成本低廉,如今被相当多的实验室用于制备mRNA转录本。

2. 高产量:噬菌体T7 RNA聚合酶可以转录T7启动子下游的DNA模板序列。该酶的工作效率高,在DNA上行进速度快,能以很低量的DNA模板转录出大量mRNA分子,并且可以方便地进行体系放大。

3. 灵活性:体外转录可以方便地合成不同长度的RNA分子:从几百nt到大于10 kb。因此体外转录法可灵活适应不同的下游应用需求。化学法一般只能合成长度在200 nt以内的RNA分子,合成更长的长度时将引入显著的碱基错误。

对比传统的基于病毒和DNA结构的疫苗,mRNA近年来已成为新型疫苗开发的强力候选。mRNA疫苗具有以下几点优势:

1. 高效:mRNA疫苗已被证明可以高效率地诱导特异性免疫应答且不引发显著副作用。

2. 递送效率高:mRNA疫苗通过纳米颗粒载体包裹的mRNA,可以高效地被靶细胞吸收,在胞浆中直接翻译表达且无需进入细胞核。mRNA疫苗可以方便地通过皮下注射方式接种,该方式已被证明是安全高效的接种方式。

3. 安全:mRNA疫苗的组分无感染性、不整合基因组且不导致插入突变,特别是对比病毒载体疫苗,具有更高的安全性。此外通过核苷修饰进一步调控固有免疫应答,可帮助mRNA疫苗获得更好的安全性能。

4. 易于放大生产:使用体外转录法合成的mRNA疫苗可以快速地制备,同时对比病毒载体疫苗只消耗很少的资源。此外,由于mRNA疫苗可促使体内原位合成抗原,因此省去了生产某些抗原时需要纯化和稳定蛋白的步骤。mRNA疫苗相对地更容易扩大生产的优点使其可以快速地从早期研发阶段过渡到临床和商业应用阶段,从而快速应对疫情的发展。

5. 泛用性强:mRNA作为疫苗表现出很强的泛用性,比如使用一剂疫苗即可呈递多种病毒抗原,这对于传统疫苗通常是难以实现的。