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冠状病毒人工重组载体

COVID-19冠状病毒自身无疑是其相关研究的关键试剂,但是获得可观的病毒剂量并非易事。制备病毒的一种首先被想到的方法是从被感染的个体中提取含病毒的生物样本(例如痰),然后用其感染特定的细胞系来进行生产。然而在实际情况中,含有活病毒的生物样品在获取和运输上会有诸多问题,我们也并非总能得知哪一种细胞系适合原始冠状病毒的体外培养。此外,即使是成功地从体外细胞获得了有活性的病毒颗粒,研究中想要对病毒基因组进行人工突变通常也是困难的。

面这对些问题,最佳解决方式是采用反向遗传学的方法,即利用该病毒的人工重组载体来重构病毒本身。具体方法是,构建携带目的冠状病毒基因组的DNA载体,然后将其转染到包装细胞中来产生大量活病毒。该方法的优势在于,可以便捷地进行研究所需要的载体修饰,如添加报告基因(如EGFP)或引入特定的突变。此外,鉴于野生型冠状病毒的基因组为正义单链RNA,而该种方式制备重组冠状病毒的病毒基因组模板为DNA,载体本身并不具有传染性。冠状病毒载体可以安全地使用并以最低程度的生物安全规范进行运输。

载体家的冠状病毒载体系统适用于生产重组活病毒。用户只需将我们的载体转染到合适的包装细胞中,即可重构任何种类的活性冠状病毒。用户得到的病毒可以在适当的细胞系中进一步扩增以达到研究所需要的剂量。

冠状病毒载体的结构

冠状病毒载体的结构如下图所示:

CMV启动子:人巨细胞病毒启动子(Human cytomegalovirus immediate early promoter)。CMV启动子可以驱动包装细胞中高水平的病毒基因组RNA的转录表达。

T7启动子:来源T7噬菌体的启动子。噬菌体T7 RNA聚合酶可以识别该种启动子并驱动下游基因对的高水平表达。T7启动子常用于体外转录。

冠状病毒基因组序列:这里显示的是冠状病毒基因组的全长序列(~30kb,未按比例显示)

Poly(A):载体上是由27个鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸组成的序列。对该区域的转录将添加一段Poly(A)尾巴在转录本上。Poly(A)尾巴是病毒基因组维持正常功能的必需结构之一。

HDV反基因组核酶序列:HDV反基因组核酶序列(Hepatitis delta virus antigenome ribozyme)经转录后,可催化病毒转录本在Poly(A)序列与核酶序列的交接处发生RNA自我剪切,从而形成Poly(A)尾巴。

T7终止子:来源于T7噬菌体的转录终止信号序列。T7 RNA聚合酶在经过该序列时终止转录。

BGH pA:牛生长激素多聚腺苷酸信号序列(Bovine growth hormone polyadenylation signal)。由CMV启动子驱动的转录过程将在该序列处终止。

我们的载体中的冠状病毒的基因组序列位于CMV启动子和T7启动子的下游。当载体被转染至包装细胞后,CMV启动子将启动转录病毒基因组。Poly(A)序列为转录本提供了一个Poly(A)尾巴。转录一直延伸到BGH pA并终止。HDV反基因组核酶序列将促使转录本在Poly(A)序列与核酶序列的交接处进行RNA自我剪切,形成Poly(A)尾巴以模拟自然状态中的病毒基因组。该病毒基因组随后可产生组装病毒颗粒所需的RNA和蛋白质。

作为一种可选方式,该载体亦可使用T7 RNA聚合酶进行体外转录,此时T7启动子到T7终止子之间的区域将被转录。HDV反基因组核酶序列仍然能够催化Poly(A)序列与核酶序列之间的RNA自我剪切。转录出的RNA产物可以用以转染包装细胞,然后进一步在细胞中生产病毒RNA和蛋白质,最后形成有活性的病毒颗粒。

冠状病毒的分类

自然界中冠状病毒是由一大群病毒组成的并可以感染我们所知的每一种哺乳动物。迄今已有数百种冠状病毒被发现。对于其中一些可以感染人类、牲口、宠物以及模式动物的类型,以及一些在演化上趋近于这些类型的,我们都尤为关注。这些备受关注的重要类型的冠状病毒类型系统发育树如下图所示:

重要类型的冠状病毒系统发育树

关于该些病毒的更多细节信息如下表所示:

重要类型的冠状病毒列表

载体家提供以上任何一种冠状病毒类型的DNA载体。这些载体在载体家可以进行进一步修饰,如引入报告基因或者突变。

我应该如何获取冠状病毒载体?

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生物安全性考虑

为保障安全性,我们需要考虑与用户更谨慎的合作方式。操作冠状病毒的机构和实验室需要符合恰当的生物安全规范。有关操作冠状病毒所需生物安全等级的指南可从美国生物安全协会(ABSA)发布的Risk Group Database中获取。

对于用户要求设计的载体,载体家保留对用户机构使用载体生产活病毒的法律准许和技术认证的评估权利。载体家或要求用户提供材料转移协议(Material Transfer Agreement,MTA)以限制其载体仅可用于旨在改善公众健康的研究活动。