进一步了解 >> 我们的质量体系通过ISO 9001认证。这些产品是在我们先进的设施中严格控制下生成的。

mRNA基因递送解决方案

云舟生物提供一站式的mRNA疗法开发解决方案,如疫苗、基因编辑、CAR受体以及细胞或胚胎中的重组蛋白表达服务。我们的团队拥有丰富的mRNA设计与生产经验,可以帮助研究者完成体外转录载体设计、载体克隆、体外mRNA合成、LNP-mRNA复合物制备、以及体外/体内的mRNA功能性测试,以加速mRNA疫苗与相关基因疗法的药物研发。

服务详情
IVT vector design & cloningIVT 载体设计
和克隆
IVT mRNA & LNP manufacturingIVT mRNA制备和LNP封装
Quality control (QC)质量控制
Functional validation功能性验证
icon_IVT_vector_design_cloning 体外转录(IVT)载体设计和克隆
  • IVT载体骨架可买断式授权
  • 针对以下区域优化以实现高表达效率IVT载体序列优化
    • 5’ and 3’ UTR
    • 编码序列
    • Kozak序列
  • 可稳定转录≥120 nt的polyA尾巴
  • 工业级质粒DNA制备
IVT_mRNA_LNP_manufacturing IVT mRNA和LNP制备

mRNA synthesis and QC > LNP encapsulation > LNP quality control (RiboGreen assay and dynamic light scattering).

图1 mRNA合成和 LNP封装的典型流程。

  • 从载体克隆到LNP封装快至5周
  • 可以合成mRNA和saRNA,长度可达10,000 nt,从ug至g级别
  • 高加帽效率(可达99%),使用共转录和酶加法
  • 使用以下几种核苷修饰方式减少mRNA的免疫原性并增强mRNA体内表达的稳定性:
    • m1Ψ
    • m5C
    • 5moU
  • 专有的纯化方式快速高效去除以下杂质:
    • IVT DNA模版
    • 体外转录副产物
    • 残留蛋白
    • 双链RNA(dsRNA)
  • 采用传统或定制配方的高质量LNP,具有以下优势:
    • 高封装效率
    • 低多分散系数(PDI)
    • 优化的稳定性
    • 优化的递送效率
    • 可进行抗体偶联
Quality_control_QC 质量控制

云舟生物提供多种QC方法验证IVT mRNA和LNP封装的质量。标准QC项目(打勾项)默认在COA中提供。可选QC项目根据具体项目需求提供。

IVT mRNA
LNP封装
性质分析方法科研级别临床前级别
mRNA鉴定mRNA序列Sanger测序
mRNA长度变性琼脂糖凝胶电泳
毛细管电泳(CGE)可选
性质mRNA浓度UV分光光度计
RiboGreen染色可选
外观目视检查可选
效力表达效果体外翻译后进行Western blot可选可选
细胞转染可选可选
安全性无菌性生物负荷测试可选
支原体培养法可选
qPCR可选可选
内毒素动态色谱法(KCA)可选
纯度mRNA完整性变性琼脂糖凝胶电泳
毛细管电泳(CGE)可选
A260/280UV分光光度计
加帽效率LC-MS可选
PolyA分析LC-MS可选
残留dsRNA斑点杂交可选
残留质粒 DNAqPCR可选
残留蛋白NanoOrange染色可选
残留溶剂气相色谱可选可选
检测项目性质分析方法科研级别临床前级别
LNP属性封装效率RiboGreen染色
粒径、PDI动态光散射(Zetasizer)
表面电荷动态光散射(Zetasizer)
Functional_validation 功能性验证
  • 验证不同优化的序列的实验效果(UTR、编码序列、polyA、kozak序列等)
  • 根据不同应用需求搭建不同的验证平台,比如抗原呈递、抗体表达、CAR表达、以及CRISPR
  • 使用包括大鼠和非人灵长类(NHP)动物模型验证LNP-mRNA的递送效率
试验验证
IVT载体序列优化
IVT mRNA体外转录优化
LNP-mRNA QC数据

云舟生物的LNP-mRNA产品采用优化过后的封装技术,具有良好的均一性、稳定性和递送效率。 

LNP-mRNA功能验证
抗体偶联的LNP

通过血管注射LNP时,由于LNP倾向于在肝脏细胞积累,需要人工提升LNP靶向其它组织细胞的效率。 云舟生物已建立抗体偶联的LNP-mRNA生产系统,可制备具有组织特异性的LNP-mRNA。 

Antibody conjugated LNP-mRNA

图15 LNP-mRNA偶联不同的抗体分子影响其生物分布

通过将LNP偶联特定抗体, 在一定剂量下可增强LNP对肺的靶向性。向C57BC/6J 小鼠(6-8周、雌性)尾静脉注射Fluc LNP-mRNA,分离的组织中生物发光表明Fluc的表达。 阴性对照为无LNP封装的普通IVT mRNA,同类对照为IgG2a偶联的Fluc-mRNA。

常见问题解答

Cap 0是指将N7甲基鸟苷(m7G)以5'至5'三磷酸连接的方式添加到真核mRNA的5’端。这种修饰是通过一系列共转录酶促反应添加的,其功能是调节细胞核输出、转录稳定性,并通过真核翻译起始因子(eIF4E)的识别促进mRNA的翻译。Cap 1是指除了m7G Cap之外,进一步在转录mRNA序列的第一个核苷酸(m7GpppNm)的2' O上添加甲基。在哺乳动物细胞中,Cap 1结构是mRNA被识别为自身而非先天免疫靶向的重要标志。在合成的mRNA中添加Cap 1结构可以增强体内mRNA的表达并降低其免疫原性。

体外转录mRNA的5'帽子可以以加入Cap类似物共转录的方式添加,也可以通过酶促反应在转录后添加。我们提供了两种加帽方式,其效率已通过LC-MS验证表现良好。根据客户首选的加帽方法,我们将从一开始就选择一个兼容的载体骨架来克隆IVT mRNA载体。

细胞包含位于胞质的和内涵体的两类RNA受体,它们在识别外源RNA时将激活免疫反应。修饰核苷酸通常存在于细胞的内源性RNA中。在IVT mRNA中加入某些修饰的核苷酸可降低其免疫原性,改变二级结构,并以序列依赖的方式提高翻译效率和延长半衰期。我们提供了多种类型的修饰核苷酸,包括常用的N1-甲基假尿苷(m1Ψ)和5-甲基胞苷(m5C)。N1-甲基假尿苷和5-甲基胞苷是最早发现的天然来源是 tRNA,然而,它们在 mRNA 中的功能直到最近才得到重视。尿苷和胞苷的这些甲基化衍生物可以在mRNA IVT和翻译中取代它们使用的默认核苷,而不改变传统的Watson-Crick碱基配对。在mRNA治疗中使用它们的一个主要优势是它们能够帮助RNA规避免疫受体的识别,从而减轻不必要的免疫反应,增强转录稳定性和翻译效率。

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