云舟生物提供一站式的mRNA疗法开发解决方案，如疫苗、基因编辑、CAR受体以及细胞或胚胎中的重组蛋白表达服务。我们的团队拥有丰富的mRNA设计与生产经验，可以帮助研究者完成体外转录载体设计、载体克隆、体外mRNA合成、LNP-mRNA复合物制备、以及体外/体内的mRNA功能性测试，以加速mRNA疫苗与相关基因疗法的药物研发。
IVT 载体设计 
IVT mRNA制备和LNP封装
质量控制
功能性验证
体外转录（IVT）载体设计和克隆 IVT mRNA和LNP制备图1 mRNA合成和 LNP封装的典型流程。
质量控制云舟生物提供多种QC方法验证IVT mRNA和LNP封装的质量。标准QC项目（打勾项）默认在COA中提供。可选QC项目根据具体项目需求提供。
| 性质 | 分析方法 | 科研级别 | 临床前级别 | |
|---|---|---|---|---|
| mRNA鉴定 | mRNA序列 | Sanger测序 | √ | √ |
| mRNA长度 | 变性琼脂糖凝胶电泳 | √ | √ | |
| 毛细管电泳（CGE） | 可选 | √ | ||
| 性质 | mRNA浓度 | UV分光光度计 | √ | √ |
| RiboGreen染色 | 可选 | √ | ||
| 外观 | 目视检查 | 可选 | √ | |
| 效力 | 表达效果 | 体外翻译后进行Western blot | 可选 | 可选 |
| 细胞转染 | 可选 | 可选 | ||
| 安全性 | 无菌性 | 生物负荷测试 | 可选 | √ |
| 支原体 | 培养法 | 可选 | √ | |
| qPCR | 可选 | 可选 | ||
| 内毒素 | 动态色谱法（KCA） | 可选 | √ | |
| 纯度 | mRNA完整性 | 变性琼脂糖凝胶电泳 | √ | √ |
| 毛细管电泳（CGE） | 可选 | √ | ||
| A260/280 | UV分光光度计 | √ | √ | |
| 加帽效率 | LC-MS | 可选 | √ | |
| PolyA分析 | LC-MS | 可选 | √ | |
| 残留dsRNA | 斑点杂交 | 可选 | √ | |
| 残留质粒 DNA | qPCR | 可选 | √ | |
| 残留蛋白 | NanoOrange染色 | 可选 | √ | |
| 残留溶剂 | 气相色谱 | 可选 | 可选 | |
| 检测项目 | 性质 | 分析方法 | 科研级别 | 临床前级别 |
|---|---|---|---|---|
| LNP属性 | 封装效率 | RiboGreen染色 | √ | √ |
| 粒径、PDI | 动态光散射（Zetasizer） | √ | √ | |
| 表面电荷 | 动态光散射（Zetasizer） | √ | √ |
功能性验证
IVT载体序列优化
图2 优化的UTR改善mRNA表达效率。
高斯荧光素酶mRNA使用不同的UTR组合表现出不同的表达水平。在12孔板中接种293T细胞，细胞密度2.3×105 细胞/孔。每孔转染1 ug mRNA。转染后6 h、24 h、48 h、72 h以及96 h，取20 ul细胞测定高斯荧光素酶活性。
图3 对编码序列进行密码子优化提高了mRNA的体外和体内表达水平。
(A)HEK293T细胞中表达HiExpressTM萤火虫荧光素酶IVT mRNA以及其它版本的荧光素酶mRNA。细胞生长于12孔板，每孔转染0.5 ug mRNA。转染后6 h、24 h、48 h以及72 h测定荧光素酶活性。（B）向C57BL/6成年小鼠肌肉注射30 ug LNP包封的荧光素酶mRNA，注射后6 h、24 h、48 h测定荧光素酶活性。Fluc WT表示野生型荧光素酶mRNA。Fluc WT (co)表示经过密码子优化的荧光素酶mRNA。Fluc2表示luc2荧光素酶mRNA。HiExpressTM Fluc表示云舟生物HiExpressTM萤火虫荧光素酶IVT mRNA。
图4 polyA长度分析。
使用核糖核酸酶将polyA尾巴从mRNA上切割下来，然后进行oligo dT亲和色谱纯化，LS-MS分析核苷酸信息。（A）基于尿素PAGE的polyA大小分析。变性尿素PAGE电泳mRNA酶切后的60 ng 120 nt和150 nt的polyA尾巴。（B）基于LC-MS 的polyA大小分析。120 nt长度的120 p mol polyA分子量的逆卷积质谱结果。（C）期望为120 nt的polyA尾巴长度观测分布。柱状图表明polyA长度的同一性较好。误差线表示3次酶切试验结果的标准偏差。polyA加权平均长度为123 nt。
图5. HEK293T cells were transfected with IVT EGFP mRNA with the same Cap1 and UTRs but different poly(A) tail lengths as listed above.
图6 斑马鱼EGFP IVT mRNA体内表达。
使用250 pg斑马鱼EGFP IVT mRNA显微注射单细胞期斑马鱼胚胎，注射后6 h筛选EGFP表达效果。荧光图像表明含有经过优化的Kozak序列的mRNA（version 2）在体内表达效果更佳。
IVT mRNA体外转录优化
图7 完整性良好的长序列IVT mRNA
使用变性凝胶电泳鉴定云舟生物不同批次的IVT mRNA。在不同体外转录条件下均能获得长度>10,000 nt的序列完整的IVT mRNA。
图8 基于LC-MS的加帽效率分析
（A）共转录法和（B）酶加法均能实现很高的加帽效率。
图9 修饰的核苷酸增强mRNA表达，同时减少dsRNA产生。
（A）293T细胞中表达萤火虫荧光素酶IVT mRNA。使用的mRNA包括无修饰的、N1-甲基假尿苷（N1-methylpseudouridine，m1Ψ）修饰的、以及5-甲基胞苷（5-methylcytidine，m5C）修饰的。修饰的。细胞生长于12孔板，每孔转染1 ug mRNA。293T细胞转染萤光素酶mRNA后6 h、24 h、48 h的萤光素酶活性。误差线表示标准偏差。平均荧光强度使用带颜色的柱状图表示.(B) 等量修饰的和无修饰的EGFP IVT mRNA（每斑点750 ng）经过磁柱纯化，使用斑点杂交估测dsRNA杂质含量。
残留dsRNA是IVT产物中主要引起免疫反应的杂质。 斑点杂交试验结果表明额外的纯化步骤毒药去除残留dsRNA至关重要。
图10 不同纯化方式的dsRNA去除效率。
不同的纯化方式纯化等量的hSpCas9 IVT mRNA（每斑点1500 ng），然后使用斑点杂交估测残留dsRNA。缩写：HIC，Hydrophobic interaction chromatography；IP-RP，Ion-pair reversed-phase liquid chromatography。
LNP-mRNA QC数据云舟生物的LNP-mRNA产品采用优化过后的封装技术，具有良好的均一性、稳定性和递送效率。
冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）结果显示我们封装的LNP-mRNA结构完整且大小均一。
图11 冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）视野下的LNP-mRNA
LNP保存于-80℃含有蔗糖的Tris溶液（pH7.4），冰上解冻后拍摄。比例尺=100 nm。
动态光散射（DLS）分析表明我们的LNP-mRNA可以达到很低的PDI值（PDI<0.1）。云舟生物承诺我们的LNP-mRNA的Zeta电势范围在-10 mV至+10 mV之间。
图12 LNP粒径和Zeta电势分析多分散指数（PDI）
（A）和Zeta电势（B）通过动态光散射（DLS）测定。该方法可以测量粒子运动带来的散射光强度的波动变化。反映的则是样本中的粒子尺寸的异质性。样本中的Zeta电势范围在-1.872到+1.872 mV之间。
LNP-mRNA功能验证
图13 使用LNP高效递送mRNA
对比使用传统转染试剂，LNP封装的EGFP mRNA表现出更高递送效率。向Jurkat和293T细胞转染1 ug的EGFP mRNA： （A）流式细胞术分析EGFP表达水平。（B）转染后24 h拍摄细胞荧光图片。实验中使用的EGFP mRNA均无核苷修饰。 荧光强度中值表示为MFI。
图14 小鼠转导萤光素酶mRNA（Luc mRNA），检测mRNA表达情况和免疫反应。
（A）注射后6 h、24h、和48 h通过活体成像检测萤光素酶活性。 （B）为量化外源RNA在小鼠中引发的炎症反应，注射后48小时检测小鼠血清中两种促炎细胞因子IL-6和TNF-α的浓度。 误差线表示标准偏差。小鼠种系：C57BL/6J；小鼠年龄：8周；注射方法：肌肉注射。（C）向Balb/C小鼠注射30 ug的LNP封装的mRNA，注射后14天，分离Balb/C小鼠的脾脏细胞，针对病毒抗原A、病毒抗原B以及PBS对照进行IFN-γ ELISpot试验。
抗体偶联的LNP通过血管注射LNP时，由于LNP倾向于在肝脏细胞积累，需要人工提升LNP靶向其它组织细胞的效率。 云舟生物已建立抗体偶联的LNP-mRNA生产系统，可制备具有组织特异性的LNP-mRNA。
图15 LNP-mRNA偶联不同的抗体分子影响其生物分布
通过将LNP偶联特定抗体， 在一定剂量下可增强LNP对肺的靶向性。向C57BC/6J 小鼠（6-8周、雌性）尾静脉注射Fluc LNP-mRNA，分离的组织中生物发光表明Fluc的表达。 阴性对照为无LNP封装的普通IVT mRNA，同类对照为IgG2a偶联的Fluc-mRNA。
使用说明书
手册与宣传单
MSDS
品质检验证书（COA）
检索COACap 0是指将N7甲基鸟苷（m7G）以5'至5'三磷酸连接的方式添加到真核mRNA的5’端。这种修饰是通过一系列共转录酶促反应添加的，其功能是调节细胞核输出、转录稳定性，并通过真核翻译起始因子（eIF4E）的识别促进mRNA的翻译。Cap 1是指除了m7G Cap之外，进一步在转录mRNA序列的第一个核苷酸（m7GpppNm）的2' O上添加甲基。在哺乳动物细胞中，Cap 1结构是mRNA被识别为自身而非先天免疫靶向的重要标志。在合成的mRNA中添加Cap 1结构可以增强体内mRNA的表达并降低其免疫原性。
体外转录mRNA的5'帽子可以以加入Cap类似物共转录的方式添加，也可以通过酶促反应在转录后添加。我们提供了两种加帽方式，其效率已通过LC-MS验证表现良好。根据客户首选的加帽方法，我们将从一开始就选择一个兼容的载体骨架来克隆IVT mRNA载体。
细胞包含位于胞质的和内涵体的两类RNA受体，它们在识别外源RNA时将激活免疫反应。修饰核苷酸通常存在于细胞的内源性RNA中。在IVT mRNA中加入某些修饰的核苷酸可降低其免疫原性，改变二级结构，并以序列依赖的方式提高翻译效率和延长半衰期。我们提供了多种类型的修饰核苷酸，包括常用的N1-甲基假尿苷（m1Ψ）和5-甲基胞苷（m5C）。N1-甲基假尿苷和5-甲基胞苷是最早发现的天然来源是 tRNA，然而，它们在 mRNA 中的功能直到最近才得到重视。尿苷和胞苷的这些甲基化衍生物可以在mRNA IVT和翻译中取代它们使用的默认核苷，而不改变传统的Watson-Crick碱基配对。在mRNA治疗中使用它们的一个主要优势是它们能够帮助RNA规避免疫受体的识别，从而减轻不必要的免疫反应，增强转录稳定性和翻译效率。
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