云舟生物提供一站式的mRNA疗法开发解决方案，如疫苗、基因编辑、CAR受体以及细胞或胚胎中的重组蛋白表达服务。我们的团队拥有丰富的mRNA设计与生产经验，可以帮助研究者完成体外转录载体设计、载体克隆、体外mRNA合成、LNP-mRNA复合物制备、以及体外/体内的mRNA功能性测试，以加速mRNA疫苗与相关基因疗法的药物研发。
IVT 载体设计 
IVT mRNA制备和LNP封装
质量控制
功能性验证
体外转录（IVT）载体设计和克隆 IVT mRNA和LNP制备图1 mRNA合成和 LNP封装的典型流程。
质量控制云舟生物提供多种QC方法验证IVT mRNA和LNP封装的质量。标准QC项目（打勾项）默认在COA中提供。可选QC项目根据具体项目需求提供。
| 性质 | 分析方法 | 科研级别 | 临床前级别 | |
|---|---|---|---|---|
| mRNA鉴定 | mRNA序列 | Sanger测序 | √ | √ |
| mRNA长度 | 变性琼脂糖凝胶电泳 | √ | √ | |
| 毛细管电泳（CGE） | 可选 | √ | ||
| 性质 | mRNA浓度 | UV分光光度计 | √ | √ |
| RiboGreen染色 | 可选 | √ | ||
| 外观 | 目视检查 | 可选 | √ | |
| 效力 | 表达效果 | 体外翻译后进行Western blot | 可选 | 可选 |
| 细胞转染 | 可选 | 可选 | ||
| 安全性 | 无菌性 | 生物负荷测试 | 可选 | √ |
| 支原体 | 培养法 | 可选 | √ | |
| qPCR | 可选 | 可选 | ||
| 内毒素 | 动态色谱法（KCA） | 可选 | √ | |
| 纯度 | mRNA完整性 | 变性琼脂糖凝胶电泳 | √ | √ |
| 毛细管电泳（CGE） | 可选 | √ | ||
| A260/280 | UV分光光度计 | √ | √ | |
| 加帽效率 | LC-MS | 可选 | √ | |
| PolyA分析 | LC-MS | 可选 | √ | |
| 残留dsRNA | 斑点杂交 | 可选 | √ | |
| 残留质粒 DNA | qPCR | 可选 | √ | |
| 残留蛋白 | NanoOrange染色 | 可选 | √ | |
| 残留溶剂 | 气相色谱 | 可选 | 可选 | |
| 检测项目 | 性质 | 分析方法 | 科研级别 | 临床前级别 |
|---|---|---|---|---|
| LNP属性 | 封装效率 | RiboGreen染色 | √ | √ |
| 粒径、PDI | 动态光散射（Zetasizer） | √ | √ | |
| 表面电荷 | 动态光散射（Zetasizer） | √ | √ |
功能性验证
IVT载体序列优化
图2 优化的UTR改善mRNA表达效率。
高斯荧光素酶mRNA使用不同的UTR组合表现出不同的表达水平。在12孔板中接种293T细胞，细胞密度2.3×105 细胞/孔。每孔转染1 ug mRNA。转染后6 h、24 h、48 h、72 h以及96 h，取20 ul细胞测定高斯荧光素酶活性。
图3 对编码序列进行密码子优化提高了mRNA的体外和体内表达水平。
(A)HEK293T细胞中表达HiExpressTM萤火虫荧光素酶IVT mRNA以及其它版本的荧光素酶mRNA。细胞生长于12孔板，每孔转染0.5 ug mRNA。转染后6 h、24 h、48 h以及72 h测定荧光素酶活性。（B）向C57BL/6成年小鼠肌肉注射30 ug LNP包封的荧光素酶mRNA，注射后6 h、24 h、48 h测定荧光素酶活性。Fluc WT表示野生型荧光素酶mRNA。Fluc WT (co)表示经过密码子优化的荧光素酶mRNA。Fluc2表示luc2荧光素酶mRNA。HiExpressTM Fluc表示云舟生物HiExpressTM萤火虫荧光素酶IVT mRNA。
图4 polyA长度分析。
使用核糖核酸酶将polyA尾巴从mRNA上切割下来，然后进行oligo dT亲和色谱纯化，LS-MS分析核苷酸信息。（A）基于尿素PAGE的polyA大小分析。变性尿素PAGE电泳mRNA酶切后的60 ng 120 nt和150 nt的polyA尾巴。（B）基于LC-MS 的polyA大小分析。150nt长度的120 p mol polyA分子量的逆卷积质谱结果。（C）期望为150 nt的polyA尾巴长度观测分布。柱状图表明polyA长度的同一性较好。误差线表示3次酶切试验结果的标准偏差。polyA加权平均长度为147 nt。
图5 斑马鱼EGFP IVT mRNA体内表达。
使用250 pg斑马鱼EGFP IVT mRNA显微注射单细胞期斑马鱼胚胎，注射后6 h筛选EGFP表达效果。荧光图像表明含有经过优化的Kozak序列的mRNA（version 2）在体内表达效果更佳。
IVT mRNA体外转录优化
图6 完整性良好的长序列IVT mRNA
使用变性凝胶电泳鉴定云舟生物不同批次的IVT mRNA。在不同体外转录条件下均能获得长度>10,000 nt的序列完整的IVT mRNA。
图7 基于LC-MS的加帽效率分析
（A）共转录法和（B）酶加法均能实现很高的加帽效率。
图8 修饰的核苷酸增强mRNA表达，同时减少dsRNA产生。
（A）293T细胞中表达萤火虫荧光素酶IVT mRNA。使用的mRNA包括无修饰的、N1-甲基假尿苷（N1-methylpseudouridine，m1Ψ）修饰的、以及5-甲基胞苷（5-methylcytidine，m5C）修饰的。修饰的。细胞生长于12孔板，每孔转染1 ug mRNA。293T细胞转染萤光素酶mRNA后6 h、24 h、48 h的萤光素酶活性。误差线表示标准偏差。平均荧光强度使用带颜色的柱状图表示.(B) 等量修饰的和无修饰的EGFP IVT mRNA（每斑点750 ng）经过磁柱纯化，使用斑点杂交估测dsRNA杂质含量。
残留dsRNA是IVT产物中主要引起免疫反应的杂质。 斑点杂交试验结果表明额外的纯化步骤毒药去除残留dsRNA至关重要。
图9 不同纯化方式的dsRNA去除效率。
不同的纯化方式纯化等量的hSpCas9 IVT mRNA（每斑点1500 ng），然后使用斑点杂交估测残留dsRNA。缩写：HIC，Hydrophobic interaction chromatography；IP-RP，Ion-pair reversed-phase liquid chromatography。
LNP-mRNA QC数据云舟生物的LNP-mRNA产品采用优化过后的封装技术，具有良好的均一性、稳定性和递送效率。
透射电子显微镜（TEM）结果显示我们封装的LNP-mRNA结构完整且大小均一。
图10 透射电子显微镜（TEM）视野下的LNP-mRNA（负染）
LNP保存于-80℃含有蔗糖的Tris溶液（pH7.4），冰上解冻后拍摄。比例尺=100 nm。
动态光散射（DLS）分析表明我们的LNP-mRNA可以达到很低的PDI值（PDI<0.1）。云舟生物承诺我们的LNP-mRNA的Zeta电势范围在-10 mV至+10 mV之间。
图11 LNP粒径和Zeta电势分析多分散指数（PDI）
（A）和Zeta电势（B）通过动态光散射（DLS）测定。该方法可以测量粒子运动带来的散射光强度的波动变化。反映的则是样本中的粒子尺寸的异质性。样本中的Zeta电势范围在-1.872到+1.872 mV之间。
LNP-mRNA功能验证
图12 使用LNP高效递送mRNA
对比使用传统转染试剂，LNP封装的EGFP mRNA表现出更高递送效率。向Jurkat和293T细胞转染1 ug的EGFP mRNA： （A）流式细胞术分析EGFP表达水平。（B）转染后24 h拍摄细胞荧光图片。实验中使用的EGFP mRNA均无核苷修饰。 荧光强度中值表示为MFI。
图13 小鼠转导萤光素酶mRNA（Luc mRNA），检测mRNA表达情况和免疫反应。
（A）注射后6 h、24h、和48 h通过活体成像检测萤光素酶活性。 （B）为量化外源RNA在小鼠中引发的炎症反应，注射后48小时检测小鼠血清中两种促炎细胞因子IL-6和TNF-α的浓度。 误差线表示标准偏差。小鼠种系：C57BL/6J；小鼠年龄：8周；注射方法：肌肉注射。（C）向Balb/C小鼠注射30 ug的LNP封装的mRNA，注射后14天，分离Balb/C小鼠的脾脏细胞，针对病毒抗原A、病毒抗原B以及PBS对照进行IFN-γ ELISpot试验。
抗体偶联的LNP通过血管注射LNP时，由于LNP倾向于在肝脏细胞积累，需要人工提升LNP靶向其它组织细胞的效率。 云舟生物已建立抗体偶联的LNP-mRNA生产系统，可制备具有组织特异性的LNP-mRNA。
图14 LNP-mRNA偶联不同的抗体分子影响其生物分布
通过将LNP偶联特定抗体， 在一定剂量下可增强LNP对肺的靶向性。向C57BC/6J 小鼠（6-8周、雌性）尾静脉注射Fluc LNP-mRNA，分离的组织中生物发光表明Fluc的表达。 阴性对照为无LNP封装的普通IVT mRNA，同类对照为IgG2a偶联的Fluc-mRNA。
Cap 0是指将N7甲基鸟苷（m7G）以5'至5'三磷酸连接的方式添加到真核mRNA的5’端。这种修饰是通过一系列共转录酶促反应添加的，其功能是调节细胞核输出、转录稳定性，并通过真核翻译起始因子（eIF4E）的识别促进mRNA的翻译。Cap 1是指除了m7G Cap之外，进一步在转录mRNA序列的第一个核苷酸（m7GpppNm）的2' O上添加甲基。在哺乳动物细胞中，Cap 1结构是mRNA被识别为自身而非先天免疫靶向的重要标志。在合成的mRNA中添加Cap 1结构可以增强体内mRNA的表达并降低其免疫原性。
体外转录mRNA的5'帽子可以以加入Cap类似物共转录的方式添加，也可以通过酶促反应在转录后添加。我们提供了两种加帽方式，其效率已通过LC-MS验证表现良好。根据客户首选的加帽方法，我们将从一开始就选择一个兼容的载体骨架来克隆IVT mRNA载体。
细胞包含位于胞质的和内涵体的两类RNA受体，它们在识别外源RNA时将激活免疫反应。修饰核苷酸通常存在于细胞的内源性RNA中。在IVT mRNA中加入某些修饰的核苷酸可降低其免疫原性，改变二级结构，并以序列依赖的方式提高翻译效率和延长半衰期。我们提供了多种类型的修饰核苷酸，包括常用的N1-甲基假尿苷（m1Ψ）和5-甲基胞苷（m5C）。N1-甲基假尿苷和5-甲基胞苷是最早发现的天然来源是 tRNA，然而，它们在 mRNA 中的功能直到最近才得到重视。尿苷和胞苷的这些甲基化衍生物可以在mRNA IVT和翻译中取代它们使用的默认核苷，而不改变传统的Watson-Crick碱基配对。在mRNA治疗中使用它们的一个主要优势是它们能够帮助RNA规避免疫受体的识别，从而减轻不必要的免疫反应，增强转录稳定性和翻译效率。
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