进一步了解 >> 我们的质量体系通过ISO 9001认证。这些产品是在我们先进的设施中严格控制下生成的。

EGFP mRNA与HiExpress™萤光素酶mRNA

云舟生物提供可应用于体外和体内实验的预制的EGFP IVT mRNA和萤光素酶IVT mRNA。我们的mRNA经过验证,无论在体外细胞抑或动物模型中均能高水平表达报告基因,因此可用于验证mRNA递送效率或者作为您的mRNA实验的对照组。更多定制mRNA的制备服务,请参照mRNA基因递送解决方案

亮点

  • 所有mRNA均添加Cap 1帽子、经过验证的5’和3’UTR以及一个110 nt长度的polyA尾巴,并且还可采用N1-甲基假尿苷(m1Ψ)修饰
  • HiExpressTM萤光素酶IVT mRNA经过密码子优化,具有很高的表达效率
  • 多方位的质量控制,包括测序、浓度、纯度、完整性以及无菌验证等

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运输与保存

我们的mRNA产品存储于1 mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.4),并以干冰形式发货。mRNA可在-80℃下保存12个月。请避免反复冻融mRNA。

技术详情

IVT mRNA制备与质量控制

图1 体外转录合成mRNA的典型流程

我们的IVT mRNA制备首先从设计和合成模版DNA序列开始,并考虑一系列因素如密码子选择、GC含量、热力学稳定性、RNA二级结构 等,然后将其克隆到体外转录载体中。然后对质粒DNA进行纯化、验证和线性化,然后进行体外转录反应,从而产生所需 的转录本。我们通过引入修饰的核苷酸,有助于改善mRNA的体内的翻译效率并减低免疫反应。我们采用共转录或者酶促 法进行mRNA加帽,效率可达95%以上。经过磁珠纯化后的mRNA还会通过一系列QC验证以保证终产品的质量。

试验验证

图2 在HeLa细胞中的EGFP IVT mRNA表达效果。转染的EGFP IVT mRNA为无核苷修饰的以及含有N1-甲基假尿苷(m1Ψ)修饰的。HeLa细胞生长于12孔板,每孔转染1 ug mRNA。(A)流式细胞术检测转染后24 h、48 h、72 h的EGFP表达水平。萤光强度中值(MFI)使用彩色柱子表示,EGFP阳性细胞百分比使用圆形、方形、三角形表示。误差线代表标准偏差(SD)。(B)EGFP IVT mRNA转染后48 h,HeLa细胞中的萤光表达效果。

图3 HiExpressTM萤光素酶IVT mRNA的体外与体内表达效果。(A)HEK293T细胞中表达HiExpressTM萤光素酶IVT mRNA以及其它版本的萤光素酶mRNA。细胞生长于12孔板,每孔转染0.5 ug mRNA。转染后6 h、24 h、48 h以及72 h测定萤光素酶活性。(B)向C57BL/6成年小鼠肌肉注射30 ug LNP包封的萤光素酶mRNA,注射后6 h、24 h、48 h测定萤光素酶活性。Fluc WT表示野生型萤光素酶mRNA。Fluc WT (co)表示经过密码子优化的萤光素酶mRNA。Fluc2表示luc2萤光素酶mRNA。HiExpressTM Fluc表示云舟生物HiExpressTM萤光素酶IVT mRNA。

文档

使用说明书

EGFP与HiExpressTM 萤光素酶IVT mRNA体外应⽤

常见问题解答

Cap 0是指将N7甲基鸟苷(m7G)以5'至5'三磷酸连接的方式添加到真核mRNA的5’端。这种修饰是通过一系列共转录酶促反应添加的,其功能是调节细胞核输出、转录稳定性,并通过真核翻译起始因子(eIF4E)的识别促进mRNA的翻译。Cap 1是指除了m7G Cap之外,进一步在转录mRNA序列的第一个核苷酸(m7GpppNm)的2' O上添加甲基。在哺乳动物细胞中,Cap 1结构是mRNA被识别为自身而非先天免疫靶向的重要标志。在合成的mRNA中添加Cap 1结构可以增强体内mRNA的表达并降低其免疫原性。

体外转录mRNA的5'帽子可以以加入Cap类似物共转录的方式添加,也可以通过酶促反应在转录后添加。我们提供了两种加帽方式,其效率已通过LC-MS验证表现良好。根据客户首选的加帽方法,我们将从一开始就选择。

细胞包含位于胞质的和内涵体的两类RNA受体,它们在识别外源RNA时将激活免疫反应。修饰核苷酸通常存在于细胞的内源性RNA中。在IVT mRNA中加入某些修饰的核苷酸可降低其免疫原性,改变二级结构,并以序列依赖的方式提高翻译效率和延长半衰期。我们提供了多种类型的修饰核苷酸,包括常用的N1-甲基假尿苷(m1Ψ)和5-甲基胞苷(m5C)。N1-甲基假尿苷和5-甲基胞苷是最早发现的天然来源是 tRNA,然而,它们在mRNA中的功能直到最近才得到重视。尿苷和胞苷的这些甲基化衍生物可以在mRNA IVT和翻译中取代它们使用的默认核苷,而不改变传统的Watson-Crick碱基配对。在mRNA治疗中使用它们的一个主要优势是它们能够帮助RNA规避免疫受体的识别,从而减轻不必要的免疫反应,增强转录稳定性和翻译效率。

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