BAC修饰(Recombineering)

VectorBuilder提供的BAC修饰服务质量高,价格低,周期短。通过BAC修饰,我们可以将报告基因放置在BAC特定的调控序列之后,也可以将点突变引入目的基因、或是将BAC上的片段转移到质粒载体上以及在BAC骨架上添加筛选标记等。
以下是可供选择的服务类型,按照操作步骤定义的价格和周期请点击了解更多>>
服务类型 价格 周期 备注
基因敲入
EGFP, mCherry, LacZ, GCaMP6s, Luciferase, DTR 请咨询 42-63 天

“一步法BAC修饰”中引入的抗药性筛选表达盒最终会被删除。

请咨询 63-84 天

“一步法BAC修饰”中引入的抗药性筛选表达盒最终会被删除;piggyBac ITRs会被添加到BAC骨架上。

Cre, CreERT2 请咨询 98-119 天

“一步法BAC修饰”中引入的抗药性筛选表达盒和BAC骨架上的loxP位点最终会被删除。

请咨询 98-119 天

“一步法BAC修饰”中引入的抗药性筛选表达盒和BAC骨架上的loxP位点最终会被删除;piggyBac ITRs会被添加到BAC骨架上。

其他DNA片段

请咨询

请咨询

 
点突变

常规点突变

请咨询 49-77 天

运用“两步法BAC修饰”。

请咨询 70-98 天

运用“两步法BAC修饰”;piggyBac ITRs会被添加到BAC骨架上。

删除BAC骨架上的loxP位点

pBACe3.6 请咨询 63-84 天

pBACe3.6骨架上的loxP和loxP511位点可能与Cre相互作用,删除BAC骨架上的loxP位点避免基因重组。

请咨询 63-84 天

BAC骨架上的loxP位点最终会被删除;piggyBac ITRs会被添加到BAC骨架上。

其他BAC骨架

请咨询

请咨询

 
将DNA片段从BAC转移到质粒载体上
pStart-K 请咨询 35-49 天

转移的片段大小通常不超过30 kb。

pStart-K-ITR 请咨询 35-49 天

转移的片段大小通常不超过30 kb; 质粒载体骨架包含piggyBac ITR。

其他质粒载体

请咨询

请咨询

 
在BAC骨架上添加筛选标记
Neo, Puro, piggyBac ITRs 请咨询 35-42 天

这些元件会被添加到BAC骨架loxP位点上。

其他元件

请咨询

请咨询

 

备注:

a. 周期的定义:从接受订单到发货的时间,不包括客户准备材料所需要的时间(例如:BAC克隆的购买)。

b. 上述价格包含从BACPAC中购买BAC克隆的费用,最终报价可能因引入序列的复杂性而异。

c. 此服务仅适用于在其骨架中包含loxP位点的BAC,BACPAC资源中心的大多数BAC都包含loxP位点。

如何获取BAC修饰服务?

您只需点击主页上的“发送设计咨询”按钮,就可以在线提交您的BAC修饰服务需求。您可以这样描述您的需求:“我想在这个基因的启动子之后放置一个lacZ报告基因”。我们经验丰富的技术人员将免费为您设计一个可行的方案,并向您发送包含方案、报价和周期等相关信息的链接。如果您对该方案满意,可直接将其添加到购物车中,并根据说明下单。
服务说明
免费设计BAC修饰方案
VectorBuilder经验丰富的技术团队将根据您的需求,免费为您设计一个详尽而高效的BAC修饰方案。

为您购买BAC
如果您知道您需要的BAC的ID号,请提供给我们,我们将为您购买。如果对使用的BAC有疑惑,我们也可以根据您研究的基因为您找到合适的BAC。绝大多数BAC可从CHORI 的BACPAC资源中心获取,但某些BAC需要从其他供应商购买。您也可以直接给我们寄送含有BAC的大肠杆菌。
“一步法BAC修饰”
既可用于引入大片段如在某个基因的启动子后面加上用于示踪的报告基因(图1),也可引入小改变,如点突变(图2)。
大片段的引入(图1):片段包含有目的基因(GOI)(例如LacZ或GFP报告基因)、两侧为FRT位点的药物筛选表达框,其两端具有与重组区域同源的同源臂。通过同源重组来替代BAC上的内源区域,药物筛选表达盒可用于鉴定成功修饰的BAC克隆,可通过Flp介导的重组删除该表达盒,只留下一个FRT位点。

图1. “一步法BAC修饰”示意图:在启动子后面引入目的基因(GOI)(如LacZ或GFP报告基因)

引入点突变(图2):片段包含突变区域、两侧为FRT位点的药物筛选表达框,其两端具有与重组区域同源的同源臂。通过同源重组取代BAC上的内源区域,最后通过Flp介导的重组删除该表达盒,只留下一个FRT位点。FRT位点被认为是“瘢痕”序列,因为修饰后的BAC除了所需的点突变之外,还携带这个残留的FRT。为了不影响基因功能,该瘢痕序列要放置在基因的非功能区域,如内含子或UTR区。

图2. “一步法BAC修饰”示意图:在基因的第一外显子中引入点突变并将FRT序列放置在下游内含子中

“两步法BAC修饰”
“两步法BAC修饰”用于将微小的变化(如点突变)引入BAC,而不留下FRT瘢痕序列(图3)。该方法适用于以下情况,即在预期突变位点的附近,没有合适的空间放置残留的FRT瘢痕序列。例如,如果要修饰的基因是非常大的单外显子基因,并且所需的突变位点位于基因的中间,则在点突变附近没有合适的位置来放置瘢痕序列。在这种情况下,应该使用两步法,该方法利用表达药物筛选标记的基因片段进行阳性和阴性筛选(图3)。第一步,使用该基因片段进行同源重组来替代内源靶区域,通过药物阳性筛选获得成功重组的BAC;第二步,通过同源重组,使用包含突变位点的片段替代药物筛选基因片段,利用阴性选择筛出实现点突变的BAC。

图3. “两步法BAC修饰”示意图:在大的单个外显子基因中引入点突变而不留下瘢痕序列

将筛选标记添加到BAC骨架上
使用该类BAC转染到细胞时,BAC骨架上的筛选标记将有利于其在细胞中被筛选或示踪,这将有利于通过药物筛选分离含有稳定整合BAC的细胞。

将BAC上的片段转移到质粒载体上
我们可以将BAC的任何区域(可达60 kb)转移到质粒载体上单独进行研究。例如,如果利用整个BAC构建转基因小鼠以研究在BAC上某个基因的功能,同一BAC上的其他基因可能会对研究结果有影响,而将目的基因单独分离到质粒上并使用该质粒构建转基因小鼠可以避免这个问题。另外,在技术层面,使用质粒比使用BAC更加简单。
BAC修饰的鉴定
BAC修饰区域将通过测序鉴定。由于重复序列的存在,BAC可能会发生片段缺失。为了降低这种可能性,我们将重新转化修饰后的BAC,并挑选获得单克隆,通过在整个BAC上进行多个位点的PCR扩增来确认其没有发生大片段缺失。
价格和周期
该服务的最终交付形式是含有经修饰和验证的BAC的大肠杆菌。由于该服务涉及的工作量大,所以成本相对较高,但外包给我们比自己做更实惠。由于方案复杂和易出错的性质,大多数人亲自做可能需要花费长达一年的时间,可能需要经过不断的试剂采购、学习和查找问题才能成功。为了让您更好地分配和节省时间,请把繁琐的工作交给我们。
BAC修饰服务的价格和周期见下表:
服务内容

价格

周期*

设计BAC修饰方案 免费 1-4 天
购买BAC ¥1,680 1-2 周
“一步法BAC修饰”(不删除药物筛选表达盒) ¥16,500起** 2-4 周

可选:删除“一步法BAC修饰”中引入的药物筛选表达盒

¥2,980 1-2 周

“两步法BAC修饰”

¥40,500起** 4-8 周

添加药物筛选或示踪标记到BAC骨架***

¥7,780起 1-2 周

将BAC上的片段转移到质粒载体上

¥21,500 2-4 周

BAC修饰的鉴定

免费 2-3 天

* 周期的定义:从接受订单到发货的时间,不包括客户准备材料所需要的时间(例如BAC克隆的购买和邮寄)。

** 最终价格可能因引入的序列复杂程度而异。

*** 此服务仅适用于在骨架上有loxP位点的BAC。BACPAC资源中心的大多数BAC都含有loxP位点。