shRNA文库

VectorBuilder提供高质量的针对人和小鼠基因的shRNA文库产品。对于每个物种,我们提供了两种规格的慢病毒shRNA文库产品:全基因组大库(针对约19,000个RefSeq基因)和精华基因小库(针对PubMed Central上约2,000个最常被引用的基因),每个基因对应5-6个不同的shRNA。我们的shRNA文库已通过了NGS测序和功能验证。
慢病毒shRNA文库介导的基因筛选常规流程如下图1所示。首先,利用慢病毒shRNA文库转导靶细胞,并通过慢病毒载体上携带的筛选标记(例如药物选择或荧光标记)来筛选成功转导的阳性细胞。将阳性细胞分为对照组和实验组,对实验组进行压力选择(如药物处理或重复传代),筛选出具有目的表型的细胞。基因功能筛选策略通常有三种类型:1)活力筛选,筛选出shRNA富集或锐减的活细胞; 2)报告基因筛选,筛选出报告基因的表达强度与shRNA的富集有关的细胞(如靶向调节报道基因表达shRNA);3)行为筛选,筛选出shRNA与细胞侵袭、迁移等基因相关的细胞。相对于对照组,实验组细胞筛选完成后,通过sanger测序或NGS测序鉴定出富集或锐减的shRNA。通过下游功能研究,进一步分析富集或消减的shRNA可能靶向的候选基因。
图1. 慢病毒shRNA文库介导的功能缺失筛选流程图,摘自Acta Biochim Biophys Sin 44:103-112 (2012)
产品描述
靶向性广和序列多样:针对人和小鼠,我们提供了两种规格的慢病毒shRNA文库产品:全基因组大库(针对约19,000个RefSeq基因)和精华基因小库(针对PubMed Central上约2,000个最常被引用的基因),每个基因对应5-6个不同的shRNA。shRNA靶点的设计规则参考RNAi consortium (TRC),筛选出来的shRNA都具有较高的干扰分值,使得干扰效果更可靠,筛选效果更明显。
高度均一性: 通过NGS验证表明,精华库覆盖了100%的shRNA,全基因组库覆盖了97%的shRNA,每个shRNA出现的频率较均一(见图2)。
图2. shRNA在不同质粒DNA文库的均一性。shRNA read counts are normalized by NGS library size (10 million reads) and plotted in log2 scale.
体系成熟的慢病毒载体骨架和即用型高滴度慢病毒:shRNA文库使用的骨架是第三代慢病毒载体系统,利用人U6启动子介导shRNA的表达,这一系统能在多种细胞中高效稳定地干扰靶基因,而且可以永久有效并均一地将shRNA导入细胞,所以是体外遗传筛选的理想选择。我们可以提供以上文库的即用型慢病毒(>108 TU/ml),可为您节省病毒包装和滴度测定时间。为了提高生物安全性,我们对第三代慢病毒载体系统进行了优化,使其不能进行自我复制。
图3. 慢病毒shRNA干扰载体示意图
含有双报告基因以利于筛选或追踪阳性细胞:构建文库使用的慢病毒载体骨架含有EGFP和嘌呤霉素抗性基因(Puro),可通过嘌呤霉素和绿色荧光示踪筛选阳性细胞。
图4. 使用人类shRNA精华库(MOI = 10)转导293T细胞,利用嘌呤霉素筛选4天(1.5 μg/ml)之后,EGFP在293T细胞中的表达情况。放大倍数:200x。左边:白光。右边:GFP。
shRNA文库筛选:与阵列RNAi筛选相比,RNAi文库筛选具有许多优点,如下表所示:

阵列筛选

文库筛选

如何将shRNA导入靶细胞?

将不同的单个shRNA分别应用于多孔板(例如96孔或384孔)生长的细胞

数以千计不同的shRNA同时应用于一个细胞群体

如何鉴定与特定表型相关的shRNA?

应用于单孔的shRNA序列是已知的;需要逐一仔细筛查表现出特定表型的细胞或孔

从细胞集群中筛选出特定表型的细胞;需要通过测序鉴定出细胞中富集或锐减的shRNA序列

是否能检测遗传交互?

不能或者有限制(只有单个或几个shRNA添加到每个孔中)

可以(细胞可能携带多个随机整合的shRNA)

技术要求

人工试剂成本

特殊设备要求

高(例如液体处理器,高通量成像仪等)

低(传统台式设备即可)

产品订购信息

产品名称

基因数量(个)

shRNA数量(条)

规格*

货号

价格(CNY)

人类精华基因shRNA文库

2,161 12,471

标准规格

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

Lib-LV-shRNA-hE-M ¥39,000

小鼠精华基因shRNA文库

2,233 12,472

标准规格

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

Lib-LV-shRNA-mE-M ¥39,000

人类全基因组shRNA文库

18,432 92,917

标准规格

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

Lib-LV-shRNA-hW-M ¥39,000

大规格

(>1.0x108 TU/ml, 5 ml)

Lib-LV-shRNA-hW-P ¥120,000

小鼠全基因组shRNA文库

19,790 92,917

标准规格

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

Lib-LV-shRNA-mW-M ¥39,000

大规格

(>1.0x108 TU/ml, 5 ml)

Lib-LV-shRNA-mW-P ¥120,000
* 对于精华基因文库,标准规格包装的慢病毒可以满足>40次筛选的要求,且达到100x的覆盖率。对于全基因组文库,标准规格包装的慢病毒可以满足>5次筛选的要求,且达到100x的覆盖率;大规格包装的慢病毒可以满足>25次筛选的要求,且达到100x的覆盖率。

功能筛选样品的下游服务

功能筛选后,不知道如何对样品进行NGS数据分析?您可以直接将基因组DNA样品寄送给VectorBuilder,我们将为您制备NGS样品、高通量测序和数据分析,并在短短几周内告知您样品的gRNA/shRNA的分布情况。
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