果蝇基因表达P元件转座载体pUAST

概述

我们的pUAST载体系统是一个良好、高效的转基因果蝇制备和基因表达控制系统。该系统来源于常用的果蝇P元件转座子,结合强诱导型启动子Gal4以调节转基因表达。

完整的pUAST系统包含两个载体,一个载体被称为pUAST质粒,包含两个P元件末端重复,包括待转座的区域或基因;另一个载体称为辅助质粒或转座酶质粒,编码P转座酶。

当pUAST与转座酶质粒共转染靶细胞时,辅助质粒产生的转座酶识别pUAST质粒上的两个P元件末端重复序列,然后将待转座区和两个P元件末端重复序列插入到宿主基因组中。

P元件属于II类转座子,通过“剪切—粘贴”的机制移动,从一个地方转座到另一个地方,而不留下序列本身(恰好相反,I类转座子是通过“复制—粘贴”的方式移动),在每一个插入位点都会产生一个8 bp的正向重复序列。

通过将pUAST和辅助质粒共注射到果蝇早期胚胎中可以产生转基因果蝇。P转座酶介导两个P元件末端重复序列之间的重组导致生殖系重组交换,以致产生携带靶基因的转基因后代。P转座酶仅在短时间内表达,并且随着辅助质粒的丢失,转座子在宿主基因组中的整合便成为永久性的。pUAST载体上的 mini white基因的表达,可以使果蝇的眼色发生变化,是鉴定转基因果蝇成功与否的标记。或者也可以使用 PCR或其他分子方法鉴定转基因细胞或动物。

在pUAST系统中,目的基因将被克隆到合成诱导型启动子的下游,该启动子由5个串联排列的GAL4结合位点(5xUAS)和hsp70 TATA box组成。目的基因依赖于GAL4的表达,GAL4蛋白在与pUAST质粒上的UAS位点结合后会激活目的基因的转录。因此,在没有GAL4表达的情况下,目的基因保持沉默,但是通过与表达GAL4的果蝇系杂交后,在GAL4表达的细胞中,目的基因会被转录激活。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Development. 118:401 (1993) Development and use of the pUAST inducible promoter system
Methods Mol Biol. 420:61 (2008) The use of P-element transposons to generate transgenic flies
亮点

我们的pUAST果蝇基因表达载体可有效实现P转座酶介导的基因插入或目的基因GAL4依赖性表达。我们的载体在大肠杆菌中具有高拷贝,可用于高效产生转基因果蝇。

优势

高水平表达:5×UAS/mini_Hsp70启动子可以在诱导状态下使目的基因高水平表达。

选择性表达: 不存在GAL4的情况下,目的基因的转录水平很低或没有;在GAL4的存在下,则能实现高水平的基因转录。

不足之处

基因组随机插入:p元件的随机整合,使得插入位点难以定位,基因组位置也有可能影响转基因的表达。此外,转基因插入到基因或基因组内的调控元件可能影响内源基因。

效率中等:使用P元件载体实现种系转基因通常比φC31整合酶介导的系统(pUASTattB)效率低。

潜在的泄漏表达:在某些情况下,即使没有GAL4,目的基因也会发生低水平泄漏表达。

技术复杂:转基因果蝇的产生需要胚胎注射和飞行饲养,具有一定的技术复杂性。

载体关键元件

P-element 3’ end: Right terminal repeat, or 3' terminal repeat, of the P element. When a DNA sequence is flanked by the 3’ and 5’ P-element terminal repeats, the P transposase can recognize them and insert the flanked region into the host genome.

5×UAS/mini_Hsp70: The Drosophila melanogaster heat shock protein 70 (Hsp70) minimal promoter fused with five tandem galactose upstream activating sequences (5×UAS). This is a strong promoter, tightly inducible by GAL4.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 terminator: Simian virus 40 transcriptional terminator. Contains the SV40 small T intron and the SV40 early polyadenylation signal.

mini-white: A variant of the Drosophila white gene. The mini-white gene is a dominant marker for adult fruit fly eye color, which can be used as a reporter to identify transgenic events in a white mutant background.

P-element 5’ end: Left terminal repeat, or 5' terminal repeat, of the P element. When a DNA sequence is flanked by the 3’ and 5’ P-element terminal repeats, the P transposase can recognize them and insert the flanked region into the host genome.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.