果蝇基因表达双整合系统载体pUASTB

概述

我们的pUASTB载体系统是一个高效的转基因果蝇制备和基因表达控制系统。该系统能够利用果蝇P元件转座子系统(如pUAST)或噬菌体φC31整合系统(如pUASTattB)并结合强诱导型启动子Gal4调节转基因的表达。因此,pUASTB载体系统可用于P转座子和φC31整合酶介导目的基因插入。目的基因会被克隆到pUASTB两个P-元件末端重复序列中间和attB重组位点附近的区域。

为了实现P转座子介导的插入,将pUASTB质粒和表达P转座酶的辅助质粒共同导入宿主细胞或胚胎中。 接着,由辅助质粒产生的转座酶识别pUASTB质粒上的两个P元件末端重复序列,并将包含两个P元件末端重复之间的序列插入宿主基因组中。

为了实现φC31整合酶介导的插入,将pUASTB质粒和表达φC31整合酶的辅助质粒共同导入宿主细胞或含有attP位点的胚胎中。φC31整合酶介导attB和attP位点之间的不可逆重组,导致pUASTB载体线性化并整合到宿主基因组中。

mini white基因的表达,可以使果蝇的眼色发生变化,是鉴定转基因果蝇成功与否的标记。

在pUASTB系统中,目的基因将被克隆到合成诱导型启动子的下游,该启动子由5个串联排列的GAL4结合位点(5xUAS)和hsp70 TATA box组成。目的基因依赖于GAL4的表达,GAL4蛋白在与pUAST质粒上的UAS位点结合后会激活目的基因的转录。因此,在没有GAL4表达的情况下,目的基因保持沉默,但是通过与表达GAL4的果蝇系杂交后,在GAL4表达的细胞中,目的基因会被转录激活。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Development. 118:401 (1993) Development and use of the pUAST inducible promoter system
Methods Mol Biol. 420:61 (2008) The use of P-element transposons to generate transgenic flies
Proc Natl Acad Sci U S A. 97:5995 (2000)
Proc Natl Acad Sci U S A. 95:5505 (1998)
Description of the φC31 integrase system
Proc Natl Acad Sci U S A. 104:3312 (2007) Use of pUASTattB and germ-line-specific φC31 integrase to construct transgenic Drosophila
Genetics. 166:1775 (2004) Use of pUASTB to construct transgenic Drosophila
亮点

我们的pUAST果蝇基因表达载体可有效实现P转座酶或φC31整合酶介导的基因插入或目的基因GAL4依赖性表达。我们的载体在大肠杆菌中具有高拷贝,可用于高效产生转基因果蝇。

优势

特定位点插入:基于φC31的插入具有位点特异性,通常仅发生在attP位点,降低了破坏内源基因或插入位点不当影响转基因表达的风险。

高水平表达:5×UAS/mini_Hsp70启动子可以在诱导状态下使目的基因高水平表达。

选择性表达: 不存在GAL4的情况下,目的基因的转录水平很低或没有;在GAL4的存在下,则能实现高水平的基因转录。

高效:使用φC31整合酶实现种系转基因比基于P元件的载体系统如pUAST更有效。

不足之处

基因组随机插入:p元件的随机整合,使得插入位点难以定位,基因组位置也有可能影响转基因的表达。此外,转基因插入到基因或基因组内的调控元件可能影响内源基因。

潜在的泄漏表达:在某些情况下,即使没有GAL4,目的基因也会发生低水平泄漏表达。

技术复杂:转基因果蝇的产生需要胚胎注射和飞行饲养,具有一定的技术复杂性。

需要attP插入位点:使用pUASTattB载体系统制备转基因果蝇,需要使用基因组中携带attP“着陆位点”的特异宿主。

载体关键元件

P-element 3’ end: Right terminal repeat, or 3' terminal repeat, of the P element. When a DNA sequence is flanked by the 3’ and 5’ P-element terminal repeats, the P transposase can recognize them and insert the flanked region into the host genome.

5×UAS/mini_Hsp70: The Drosophila melanogaster heat shock protein 70 (Hsp70) minimal promoter fused with five tandem galactose upstream activating sequences (5×UAS). This is a strong promoter, tightly inducible by GAL4.

Kozak: Drosophila Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 terminator: Simian virus 40 transcriptional terminator. Contains the SV40 small T intron and the SV40 early polyadenylation signal.

attB site: The bacterial attachment site, attB, recognized by the bacteriophage φC31 serine integrase. φC31 integrase can catalyze site-specific integration of attB-containing plasmids into attP-containing docking or landing sites that have been introduced into host genomes.

mini-white: A variant of the Drosophila white gene. The mini-white gene is a dominant marker for adult fruit fly eye color, which can be used as a reporter to identify transgenic events in a white mutant background.

P-element 5’ end: Left terminal repeat, or 5' terminal repeat, of the P element. When a DNA sequence is flanked by the 3’ and 5’ P-element terminal repeats, the P transposase can recognize them and insert the flanked region into the host genome.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.