哺乳动物基因FLEX介导条件性表达质粒载体(Cre-switch系列)

概述

在哺乳动物细胞和动物中,该常规质粒FLEX(Flip-Excision)条件性基因表达载体系统Cre-switch,通过Cre重组酶条件性控制两个ORF的表达。FLEX Cre-switch系统利用位于两个平行反向ORF两侧的Lox-变体重组位点,在Cre重组酶的调控下失活一个目的基因的表达,而激活另一个目的基因表达。

FLEX Cre-switch系统由两对异型Lox-变体重组位点组成,其中野生型序列称为LoxP,突变体称为Lox2272,分别位于两个基因ORF的两侧。 两个ORF相互反向,其中一个ORF具有正确的读码方向(相对于启动子)。两种Lox-变体都可被Cre识别,但只有相同的Lox位点对可以彼此重组,与其他Lox-变体不能进行重组。LoxP和Lox2272位点以交替方式位于两个ORF两端,每对位点互为反向。Cre重组酶不存在的情况时,第一个ORF由于其编码方向与启动子方向相同,可以在客户定制的启动子驱动下正常表达,而第二个ORF由于其方向相反则无法正常表达。在Cre的存在下,LoxP和Lox2272位点对分别重组,导致两个ORF方向反转,且其中的一对重组位点将具有相同的方向,Cre会介导产生正向重组切割,继而分别留下一个不同的重组位点。 ORF方向的反转,使得第二个OR可以在启动子的驱动下正常表达,而第一个ORF将不表达。 由于ORF侧翼是两个不同的Lox-变体位点,所以即使存在Cre也不会进一步发生重组。 

虽然该载体系统可用于组织培养细胞,但它更适用于制备转基因动物。 携带这种载体的转基因动物起初会表达第一个ORF基因,当与携带组织特异性Cre的转基因动物杂交时,在携带两种载体的后代转基因动物中,特别是在表达组织特异性Cre的细胞中,第二个ORF将会被激活表达,而第一个ORF的表达将会失活。

抗性筛选或荧光基因可以添加到该载体中,以便于通过药筛或者荧光筛选出永久整合外源基因的细胞。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Gene. 216:55 (1998) Characterization of LoxP mutants, including Lox2272
Nat Biotechnol. 21:562 (2003) Development of the FLEX switch system
J Neurosci. 28:7025 (2008) Application of a FLEX system
亮点

该载体用于在哺乳动物细胞和动物中,Cre介导的两个ORF间的条件性基因表达。第一个ORF最初处于正常表达状态,通过Cre重组酶的共表达后两个ORF编码方向发生反转,从而实现第一个ORF的失活和第二个ORF的表达。

优势

基因激活失活可控:两个ORF的方向彼此相反确保当表达正向方向的ORF时,反向的ORF被抑制,可防止基因发生泄漏表达。

技术简单:常规转染即可把质粒转入细胞,相比起病毒载体需要进行病毒包装,过程更简单。

载体容量非常大:我们的载体总容量可达30 kb,其中质粒骨架只占3 kb,有足够大的容量可以放置客户所感兴趣的序列。

高水平表达:常规质粒转染细胞后,可以产生非常高的拷贝数(每个细胞多达几千拷贝),使外源基因能高水平表达。

适用于动物体内研究:虽然该载体系统可用于组织培养细胞,但它更适用于制备Cre介导的条件性基因表达转基因动物。

不足之处

载体DNA非整合型:常规质粒在细胞里主要以游离DNA状态存在,所以常规质粒转染也称为瞬时转染。然而,质粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因组中(质粒转染每102~106个细胞可能会有一个细胞的基因组被整合,整合效率取决于细胞类型)。如果将携带了药物抗性基因或者荧光标记基因的载体转到细胞中,在经过扩大和传代培养后,可以使用药物筛选或细胞分选来获得稳定整合了该载体的细胞。

可转染的细胞类型受限:不同类型细胞的质粒转染效率差异很大。非分裂细胞比分裂细胞更难转染,原代细胞比永生化细胞系更难转染。一些重要的细胞类型更是难以转染,如神经元和胰岛β细胞。另外,质粒转染局限于体外细胞实验,很少运用到活体实验。

基因拷贝数在不同细胞中呈现差异性:尽管成功的转染可以在单个细胞里产生非常高的拷贝数,但不同细胞间却有高度的差异性。在一些细胞中,质粒拷贝数非常高,而在另外一些细胞却是低拷贝甚至没有。而病毒转导更倾向于相对均匀地把基因转到细胞中。

载体关键元件

Promoter: The promoter driving your genes of interest is placed here.

Lox2272: Recombination site for Cre recombinase. Mutated Lox site with two base substitutions of wild type LoxP. Incompatible with LoxP sites. When Cre is present, the LoxP and LoxP2272 sites will be cut and recombine with compatible sites.

LoxP: Recombination site for Cre recombinase. Incompatible with Lox2272 sites. When Cre is present, the LoxP and Lox2272 sites will be cut and recombine with compatible sites.

ORF #1: The open reading frame of a gene of interest is placed here, in a sense orientation. This gene can be expressed without Cre-mediated recombination.

ORF #2: The open reading frame of a gene of interest is placed here, in an antisense orientation. This gene can only be expressed after Cre-mediated recombination.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.