哺乳动物gRNA打靶效率检测质粒载体

概述

CRISPR/Cas9载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一,可以快速有效地在基因组的靶位点产生突变(另外两种应用广泛的是ZFN和TALEN)。这些质粒载体编码序列特异性RNA介导的DNA核酸酶(或切口酶),可用于编辑基因组中特定位点的DNA序列。

Cas9属于RNA引导的DNA核酸酶,是天然原核免疫系统的一部分,赋予细菌对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抗性。在细胞内,Cas9核酸酶与引导RNA(gRNA)形成复合物,该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特异性。gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上,然后切割基因组中的靶位点。

常规质粒gRNA特异性检测载体设计用于测试CRISPR/Cas9对一个或多个gRNA靶序列的切割效率。该系统允许用户通过比对多个gRNA靶位点来筛选出最有效的CRISPR/Cas9靶点。

常规质粒gRNA特异性检测载体系统的基础是位于强启动子EF1A下游的无活性且分隔开的EGFP ORF。将待测试的gRNA靶位点克隆在两个不完整的无功能性的EGFP ORF(称为EGFP-L和EGFP-R)之间。EGFP-L由EGFP ORF的上游468 bp组成,EGFP-R对应于EGFP ORF下游的268 bp-720 bp。EGFP-L的3'末端的200 bp与EGFP-R的5'末端的200 bp具有序列同源性。

当常规质粒gRNA特异性检测载体单独转染到细胞中时,不会观察到绿色荧光,因为EGFP-L和EGFP-R都不编码功能性荧光蛋白。然而,如果将该载体与Cas9和相应的gRNA载体一起共转染到细胞中,则gRNA-Cas9复合物将被募集到EGFP-L和EGFP-R之间的gRNA靶序列,从而切割产生双链DNA断裂(DSB),随后EGFP-L和EGFP-R的同源区域发生同源重组。同源重组将产生完整的功能性EGFP ORF,继而产生绿色荧光蛋白。在该系统中,可以在EGFP-L和EGFP-R之间串联克隆多个gRNA靶位点(每个都应包含PAM序列),并且可以通过与Cas9和相应的gRNA共转染分别测试。通过分析产生EGFP荧光细胞的效率,比较不同gRNA靶位点被CRISPR/Cas9切割的效率。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Appl Biochem Biotechnol. 180:655 (2016) Description of gRNA sensor system
亮点

该载体系统设计用于通过观察EGFP荧光,比较哺乳动物细胞中CRISPR/Cas9 gRNA的切割效率。该常规载体技术简单,易于使用。

优势

测试系统简单:使用该系统分析gRNA靶点切割效率简单、快速。

灵敏且稳定:即使在拷贝数非常低的细胞中,EF1A强启动子和EGFP荧光的稳定表达的特性也有助于检测到荧光信号。

技术简单:常规转染即可把质粒转入细胞,相比起病毒载体需要进行病毒包装,过程更简单。

不足之处

系统简化:在常规质粒gRNA特异性检测载体中,gRNA靶序列与基因组中目的基因的遗传背景不同。在进行测试时,gRNA特异性检测载体可以以高拷贝的形式存在于细胞中。在该测试系统中,CRISPR/Cas9对靶位点的切割效率可能在某种程度上会发生改变。

无法检测脱靶效应:该系统仅能检测CRISPR/Cas9对gRNA靶位点的切割效率,而无法提供关于脱靶效应的数据。

载体关键元件

EF1A promoter: Human eukaryotic translation elongation factor 1 α1 promoter. A strong, constitutive promoter driving the expression of EGFP-L:gRNA Target:EGFP-R cassette.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

EGFP-L: Corresponds to positions 1-468 bp of the EGFP ORF. This does not encode a functional fluorescent protein.

gRNA Target Sequence: The gRNA target sequence to be tested is cloned here. Multiple gRNA target sequences can be cloned here in tandem. PAM sequence must be included.

EGFP-R: Corresponds to positions 268-720 bp of the EGFP ORF. This does not encode a functional fluorescent protein.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as mCherry, should avoid green fluorescent protein), or a dual-reporter gene (such as mCherry/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.