哺乳动物CRISPR(单gRNA)表达质粒载体

概述

CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9)核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一(另外两种是ZFN和TALEN),可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。这些质粒载体编码的特异性RNA,能够引导DNA核酸酶(或缺刻酶)编辑基因组中特定位点的DNA序列。

Cas9是RNA引导DNA核酸酶,是天然原核免疫系统的一部分,赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内,Cas9核酸酶与引导RNA(gRNA)形成复合物,该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用,gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上,然后切割基因组中的靶位点。为了方便使用,我们设计的CRISPR/Cas9载体能够在一个载体上同时有效表达Cas9核酸酶(或缺刻酶)和引导RNA(gRNA)。

我们的CRISPR/Cas9表达载体中有两种Cas9核酸酶供选择,一种是标准的人源化Cas9(hCas9),能够有效地在靶位点产生双链断裂(DSBs);另一种是“缺刻酶”(Cas9_D10A),仅在DNA中产生单链切割。如果将Cas9_D10A缺刻酶与靶向两条互补链的两个gRNA一起使用,缺刻酶会在两条链上产生单链切割,从而导致靶位点处产生DSB。这种方法通常会减少CRISPR/Cas9脱靶效应,因为它需要两个gRNA同时靶向靶位点。

细胞通过非同源末端连接途径(NHEJ)修复通常会产生小的片段或碱基缺失,插入和碱基置换等突变。当这些突变破坏蛋白质编码区(例如引起移码缺失)时,会引起功能性基因敲除。在少数情况下,CRISPR/Cas9载体和外源供体DNA模板共同导入细胞时,细胞会通过同源性修复(HDR)机制来修复DSB,靶基因DNA序列会被模板序列取代,碱基发生改变,如点突变等。缺刻基因组DNA也会经常发生同源修复(HDR),如将外源模板DNA与Cas9_D10A缺刻酶一起导入细胞中,有可能产生碱基改变。

利用CRISPR/Cas9系统可以有效靶向大部分DNA序列,而NGG(有时是NAG)是必须的。NGG叫做前间区序列邻近基序(PAM),位于靶DNA,gRNA识别序列的3'末端。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Science 339:819-23 (2013) Description of genome editing using the CRISPR/Cas9 system
Cell. 154:1380–9 (2013) Use of Cas9 D10A double nicking for increased specificity
Nat. Biotech. 31:827–832 (2013) Specificity of RNA-guided Cas9 nucleases

亮点

我们的CRISPR/Cas9表达载体可以用于快速高效靶向细胞基因组,并在靶位点并产生碱基缺失等突变。为了在特定的靶位点引入突变,需要与靶DNA序列匹配的gRNA序列以及核酸酶hCas9(产生DSB)或其变体Cas9_D10A缺刻酶(单链切割)。

优势

瞬时表达:转染CRISPR/Cas9质粒载体后,Cas9蛋白和gRNA会在靶细胞中大量瞬时表达。如果没有药物筛选,质粒会随着时间流逝而丢失,在基因组编辑发生后,靶细胞中的Cas9和gRNA也会逐渐消失。

简单易懂:gRNA和靶位点之间的简单同源关系使得CRISPR/Cas9系统简单且易于设计。

不足之处

具有脱靶效应:已有文献报道CRISPR/Cas9具有脱靶效应,通常TALEN系统比CRISPR/Cas9具有更低的脱靶活性。通过将Cas9_D10A缺刻酶与两种gRNA结合使用(如上所述),可以显著减轻脱靶效应。

PAM要求:CRISPR/Cas9靶位点必须包含NGG序列(使用较多),也叫做PAM序列,位于gRNA识别序列3'末端。

载体关键元件

U6 Promoter: This drives high level expression of the gRNA.

Guide sequence: Specifies the target sequence of the Cas9 nuclease.

gRNA scaffold: Structural portion of the gRNA to allow complexing with Cas9.

Terminator: Terminates transcription of the gRNA.

CBh promoter: Chicken beta-actin promoter. Drives expression of Cas9 nuclease.

Nuclease: Cas9 nuclease variant chosen by user.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.