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载体指南

哺乳动物非编码RNA表达质粒载体

概述

常规非编码RNA表达质粒载体是在多种哺乳动物细胞中转染和表达非编码RNA的高效工具。非编码RNA是一类长度小于30个核苷酸或者大于200个核苷酸的功能性RNA,包括:小分子RNA(micro RNA, miRNA)、小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)、Piwi蛋白互作RNA(piwi-interacting RNA, piRNA),小核RNA(small nuclear RNA, snRNA)、核仁小RNA(small nucleolar RNA, snoRNA)、基因间长链非编码RNA (large intergenic non-coding RNA, lincRNA)、内含子长链非编码RNA(intronic long non-coding RNA, intronic lncRNA)、天然反义转录物(natural antisense transcripts, NAT)、增强子RNA(enhancer RNA , eRNA)和启动子相关RNA(promoter-associated RNA , PAR)等。所有这些非编码RNA均不被翻译成蛋白质,但是在许多细胞生理过程中扮演了重要角色,如DNA复制、表观遗传调控、转录和转录后调控、以及翻译调控等。

常规的非编码RNA表达质粒载体使用RNA聚合酶II型启动子驱动用户定制的非编码RNA的表达,可采用组织特异性、诱导型、或者驱动强度不同的启动子以满足不同的实验需求。对于RNA聚合酶II介导的转录过程,其转录起始位点位于启动子的3‘端,而终止位点位于Poly A序列。因此该载体的非编码RNA序列的转录本带有一些额外的上游和下游序列。

该载体可以用于转染多种类型的哺乳动物细胞。在生物医学领域,常规质粒转染是将质粒载体导入哺乳动物细胞中是最广泛的方法。虽然近年来开发了不少更为先进的基因导入载体系统(如慢病毒载体、腺病毒载体、AAV载体和piggyBac等),但常规质粒转染仍被大多数实验室使用,这主要得益于其在技术上的简便性以及在各种类型细胞中的高效转染率。常规质粒载体转染的关键特点是短暂性,并且在宿主基因组中的整合效率非常低(通常小于1%)。

参考文献 主题
Cell. 157:77 (2014) Review on non-coding RNAs
Front Genet. 6:2 (2015) Review on functionality of non-coding RNAs
Oncogene. 30:4750 (2011) Regular plasmid mediated expression of long non-coding RNA
亮点

我们的非编码RNA质粒表达载体系统已经过优化,其在大肠杆菌中具有高拷贝复制能力,且对细胞具有高效转染率。根据用户选择的筛选标记基因,可对转染了该载体的细胞进行筛选或者可视化追踪。

优势

技术简单:常规转染即可把质粒转入细胞,相比起病毒载体需要进行病毒包装,过程更简单。

载体容量非常大:我们的载体总容量可达30 kb,其中质粒骨架只占3 kb,有足够大的容量可以放置客户所感兴趣的序列。

高水平表达:常规质粒转染细胞后,可以产生非常高的拷贝数(每个细胞多达几千拷贝),使外源基因能高水平表达。

不足之处

瞬时转染:常规质粒在细胞里主要以游离DNA状态存在,所以常规质粒转染也称为瞬时转染。然而,质粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因组中(质粒转染每102~106个细胞可能会有一个细胞的基因组被整合,整合效率取决于细胞类型)。如果将携带了药物抗性基因或者荧光标记基因的载体转到细胞中,在经过扩大和传代培养后,可以使用药物筛选或细胞分选来获得稳定整合了该载体的细胞。

可转染的细胞类型受限:不同类型细胞的质粒转染效率差异很大。非分裂细胞比分裂细胞更难转染,原代细胞比永生化细胞系更难转染。一些重要的细胞类型更是难以转染,如神经元和胰岛β细胞。另外,质粒转染局限于体外细胞实验,很少运用到活体实验。

基因拷贝数在不同细胞中呈现差异性:尽管成功的转染可以在单个细胞里产生非常高的拷贝数,但不同细胞间却有高度的差异性。在一些细胞中,质粒拷贝数非常高,而在另外一些细胞却是低拷贝甚至没有。而病毒转导更倾向于相对均匀地把基因转到细胞中。

载体关键元件

Promoter: The promoter that drives your non-coding RNA of interest is placed here.

Non-coding RNA: The non-coding RNA of your interest is placed here.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream non-coding RNA.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.