小RNA体外转录载体

概述

我们的体外转录载体是简单有效的RNA转录系统,适用于各种研究。小RNA体外转录载体产生的小RNA,适用于生化研究、shRNA敲除或CRISPR/gRNA介导的基因编辑等细胞或胚胎注射,以及需要特定短RNA序列的其他应用。

该系统利用目的序列上游的T7启动子,通过T7噬菌体RNA聚合酶(T7 RNAP)和三磷酸核苷酸,在适当的反应条件下高效生成小RNA。我们建议您参考已发表文献中经测试的体外转录步骤说明来进行体外转录。

T7 RNAP对于有效的转录起始具有碱基要求,且这些碱基已经被放置到载体上。T7启动子3'末端的前两个碱基是GG,紧接着是客户的目的序列。

我们的小RNA体外转录载体会发生失控转录,这意味着T7 RNAP的转录能进行到DNA模板的末端,不会在质粒内的任何特定位点终止。因此,在体外转录之前,应通过使用SapI来单酶切线性化环状质粒。SapI单酶切位点正好位于目的序列的下游。值得注意的是,待转录的序列不能含有所用线性化酶切位点,以免产生截短的mRNA。不纯的酶切产物可能会抑制随后的转录反应,因此建议通过柱子或酚氯仿来纯化酶切产物。

在体内应用中,许多RNA都会进行5'末端的修饰,称为5'加帽。对于不同的实验目的,未加帽的体外转录小RNA通常能产生良好的实验效果。请根据您的实验性质来决定RNA是否需要加帽。 如果需要,则可以通过使用帽子类似物共转录或使用加帽酶转录后修饰获得加帽RNA。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Nucleic Acids Res. 7:1931 (1979) Cloning and characterization of the T7 promoter
Methods Mol Biol. 703:29 (2011) Protocols for the synthesis of RNA by in vitro transcription
Methods Mol Biol. 941:59 (2012) Preparation of short RNA by in vitro transcription
Protein Expr Purif. 9:142 (1997) Protocol for expression and purification of T7 RNAP for in vitro transcription
亮点

我们的小RNA体外转录载体能高效用于T7 RNAP介导的体外转录。该载体在大肠杆菌中具有高拷贝复制能力,易于酶切,有助于大量生成小RNA。

优势

效率高:T7 RNAP是高效酶,其介导的体外转录可大量产生功能性RNA。

技术简单:操作简便,比在细胞中表达mRNA容易,且在细胞中表达mRNA还需要进行转染和细胞培养。

不足之处

方向特定:该载体系统只含有单个体外转录启动子,如需要有义和反义转录物,则需要两个载体。

失控转录:为了产生正确有效的转录产物,在进行转录反应之前需要通过限制性内切酶线性化质粒模板。

载体关键元件

T7 promoter: A promoter for the RNA polymerase from T7 bacteriophage. Drives high-level transcription of the downstream sequence of interest.

Transcribed sequence: Your chosen DNA sequence of interest to be transcribed into RNA is placed here.

SapI: Unique restriction endonuclease site that can be used to linearize the plasmid prior to in vitro transcription.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.