哺乳动物shRNA表达PiggyBac转座载体

概述

我们的PiggyBac shRNA干扰载体系统是一种可稳定干扰多种细胞类型靶基因表达的简单而有效的方法。这种基于转座子的系统利用质粒转染(非病毒转导)将shRNA表达盒永久地整合到宿主细胞基因组中,由人类U6启动子驱动表达的shRNA将会导致靶基因mRNA的降解。与合成siRNA相比,PiggyBac shRNA干扰具有明显的优势(见下文载体优势)。

PiggyBac shRNA干扰载体系统包含两个载体,一个载体被称为辅助质粒,负责编码转座酶;另一个载体被称为转座子质粒,包含两个末端重复序列(TRs)以及两者之间的被转座区域,shRNA表达盒就克隆在这个区域。

当辅助质粒和转座子质粒共转染靶细胞时,辅助质粒产生的转座酶将会识别转座子的两个TR元件,然后将被转座区和两个TR元件插入到宿主基因组中。转座插入通常发生在包含TTAA序列的宿主染色体位点,并在转座子两侧出现TTAA重复序列。PiggyBac属于II类转座子,通过“剪切—粘贴”的机制移动,从一个地方转座到另一个地方,而不留下序列本身(恰好相反,I类转座子是通过“复制—粘贴”的方式移动)。由于辅助质粒是通过瞬时转染进入宿主细胞的,故会逐渐丢失。随着辅助质粒的丢失,表达shRNA的转座子在宿主基因组中变成了永久整合。当这些宿主细胞再次被辅助质粒转染,整合的转座子会再次通过“剪切—粘贴”的机制移动。

关于该载体系统的更多资料,请参考以下文献。

参考文献 主题
Mol Cell Biochem. 354:301 (2011) Review
Cell. 122:473 (2005) Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice

亮点

我们的PiggyBac转座子载体与辅助质粒是经过优化的,可在大肠杆菌中高拷贝复制,该载体系统对多种类型的靶细胞均具有高效的转导效率。人类U6启动子能够驱动shRNA的高水平转录,同时,我们经过优化的shRNA茎-环序列可高效形成有效的干扰RNA。

优势

永久性整合和干扰:常规质粒转染只能实现外源基因的瞬时表达,这种外源基因会随着宿主细胞的分裂而不断丢失,在快速分裂的细胞中显得尤为显著。相反,将PiggyBac转座子载体和辅助质粒一起转染到哺乳动物细胞中,由于转座子在转座酶的作用下,转座子上的DNA序列能稳定地整合到宿主细胞的染色体中。因此,U6启动子驱动shRNA的组成型表达对靶基因的干扰是稳定和永久的,这对于某些实验目标来说可能是一个重要的优势。如可对培养细胞或活体干扰表型进行长期分析,有助于分离具有不同干扰水平和/或不同表型的克隆;当干扰载体携带荧光标记如EGFP时,可通过流式分选具有不同荧光强度(荧光强度和整合数量有关,进而与干扰程度有关)的细胞。

可逆性:如果再次使用辅助质粒转染携带PiggyBac shRNA转座子的细胞,可将表达shRNA的转座子从某些细胞的基因组中切除,而不留下任何痕迹。但是,这种情况只发生在一小部分细胞中。

技术简单:通过常规转染即可把质粒转入细胞,相比起病毒载体需要进行病毒包装,过程更简单。

安全性:常规转染不会引起与病毒载体相关的安全性问题。

不足之处

转染细胞类型受限:PiggyBac载体进入细胞依赖于转染。不同类型的细胞,其转染效率差异非常大。非分裂细胞通常比分裂细胞更难转染,原代细胞比永生化细胞更难转染,一些重要的细胞类型转染难度更大,如神经元和胰岛β细胞。另外,质粒转染主要局限于体外应用,很少应用于体内实验(但可以应用于转基因动物模型制备)。以上因素在一定程度上制约了PiggyBac系统的应用。

载体关键元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the piggyBac transpose can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome.

U6 Promoter: Drives expression of the shRNA. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.

Sense, Antisense: These sequences are derived from your target sequences, and are transcribed to form the stem portion of the “hairpin” structure of the shRNA.

Loop: This optimized sequence is transcribed to form the loop portion of the shRNA “hairpin” structure.

Terminator: Terminates transcription of the shRNA.

hPGK promoter: Human phosphoglycerate kinase 1 gene promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

rBG pA: Rabbit β-globin polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream marker gene.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. See description for 5’ ITR.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.