哺乳动物增强子检测PiggyBac转座载体(体内检测系列)

概述

该载体系统设计用于在小鼠模型中,高效分析哺乳动物增强子。通常情况下,将感兴趣的增强子克隆到该载体小鼠最小启动子Hsp68的上游,并将构建好的载体用于制备转基因小鼠。对转基因胚胎或成年小鼠中LacZ报告基因的表达情况进行检测,可以进一步分析增强子的活性。

PiggyBac载体系统可以非常高效地把外源DNA插入哺乳动物细胞的基因组,该系统技术简单,可利用质粒转染(非病毒转导)把您所感兴趣的基因长期稳定地整合到靶细胞基因组。

PiggyBac系统包含两个载体,一个载体被称为辅助质粒,负责编码转座酶;另一个载体被称为转座子质粒,包含两个末端重复序列(TRs)以及两者之间的被转座区域,需要被转座到宿主基因组中的目的基因就克隆在这个区域。当辅助质粒和转座子质粒共转染靶细胞时,辅助质粒产生的转座酶将会识别转座子的两个TR元件,然后将被转座区和两个TR元件插入到宿主基因组中。转座插入通常发生在包含TTAA序列的宿主染色体位点,并在转座子两侧出现TTAA重复序列。

PiggyBac属于II类转座子,通过“剪切—粘贴”的机制移动,从一个地方转座到另一个地方,而不留下序列本身(恰好相反,I类转座子是通过“复制—粘贴”的方式移动)。由于辅助质粒是通过瞬时转染进入宿主细胞的,故会逐渐丢失。随着辅助质粒的丢失,转座子在宿主基因组中变成了永久整合。当这些宿主细胞再次被辅助质粒转染,整合的转座子会再次通过“剪切—粘贴”的机制移动。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Nature. 444:499 (2006) Genome-wide testing of putative enhancers in the mouse using a related system
Development. 105:707 (1989) Cloning of the Hsp68 minimal promoter
Mol Cell Biochem. 354:301 (2011) Review of the piggyBac systems
亮点

我们的载体系统是基于piggyBac转座子系统而构建的。待测增强子位于小鼠Hsp68最小启动子(Hsp68_mini)的上游,可控制下游LacZ报道基因的表达。有活性的增强子会促进最小启动子增强LacZ基因的表达;在缺乏活性增强子的情况下,Hsp68_mini具有非常弱的本底表达能力,会使LacZ基因弱表达或不表达。在胚胎或组织切片中,通过X-gal与LacZ的显色作用可以高度灵敏地原位检测增强子活性。

优势

简单且灵敏:使用LacZ作为报告基因,X-gal染色会产生明显的蓝色,即使在低表达水平下也可以轻松检测到,因此可以非常灵敏地判断增强子活性。

易于制备转基因动物:通过常规原核注射,可以很容易地高效制备转基因胚胎或活体小鼠。

技术简单:通过常规转染即可把质粒转入细胞,相比起病毒载体需要进行病毒包装,过程更简单。

外源基因的永久整合:常规质粒转染只能实现外源基因的瞬时表达,这种外源基因会随着宿主细胞的分裂而不断丢失,在快速分裂的细胞中显得尤为显著。相反,将PiggyBac转座子载体和辅助质粒一起转染到哺乳动物细胞中,由于转座子在转座酶的作用下,目的基因能稳定地整合到宿主细胞的染色体中,从而实现转座子载体上携带的目的基因在宿主细胞中永久表达。

载体容量大:我们的转座子载体总容量可达30 kb,其中质粒骨架只占3 kb,有足够大的容量可以放置客户所感兴趣的序列。

不足之处

需要辅助质粒:与常规质粒LacZ报告基因载体不同,piggyBac载体系统需要使用两种质粒,分别是辅助质粒和转座子质粒。为了有效地将增强子序列插入宿主基因组中,两种质粒必须存在于相同的细胞中。

载体关键元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the piggyBac transposase can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome.

Enhancer: Your enhancer of interest is cloned here.

Hsp68: The minimal promoter sequence from mouse Hsp68 (heat shock protein 68 kDa). This will drive transcription of the reporter if an enhancer element is present to activate it. In the absence of such enhancer activity, the minimal promoter only has basal activity.

LacZ: The beta-galactosidase reporter gene. The encoded enzyme converts the colorless and soluble X-gal to an intensely blue insoluble product that stains the cells in which LacZ is expressed.

SV40 early pA: Simian virus 40 early polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.