学习中心
载体指南

哺乳动物Cas9表达慢病毒载体

概述

CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9)核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一(另外两种是ZFN和TALEN),可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。这些质粒载体编码的特异性RNA,能够引导DNA核酸酶(或缺刻酶)编辑基因组中特定位点的DNA序列。

Cas9是RNA引导DNA核酸酶,是天然原核免疫系统的一部分,赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内,Cas9核酸酶与引导RNA(gRNA)形成复合物,该复合物通过与基因组中的18-22nt的同源靶序列直接相互作用,gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上,然后切割基因组中的靶位点。为了方便使用,我们设计的CRISPR/Cas9载体能够在一个载体上同时有效表达Cas9核酸酶(或缺刻酶)和引导RNA(gRNA)。

使用CRISPR打靶目的基因需要目标细胞同时表达Cas9和特异gRNA。这可以通过在同一个载体上共表达Cas9和gRNA,也可以通过在两个载体各上自表达Cas9和gRNA来实现。使用Cas9和gRNA两个载体分开表达的优势在于可使用不同的gRNA与不同的Cas9变体组合(如野生型Cas9,Cas9n,dCas9),这取决于用户的实验目的。此外,使用单独的Cas9表达载体有利于生产稳转细胞株或者动物模型,然后使用不同的gRNA进行打靶。这种方式比起gRNA/Cas9共表达载体转导可以获得更高的打靶效率。

Cas9表达慢病毒载体可以高效地将Cas9基因通过病毒颗粒导入使用质粒方式难转染的哺乳动物细胞。Cas9慢病毒载体首先以质粒的方式构建并使用E. coli扩增,然后与多个辅助质粒一同转染至包装细胞。载体上的两个LTR区域之间的DNA序列将被转录成RNA,而辅助质粒表达的病毒蛋白进一步与这些RNA组装形成完整的病毒颗粒。有活性的病毒颗粒被释放到上清液中。病毒上清液可直接转染或者浓缩后转染细胞。当病毒感染靶细胞时,病毒RNA被反转录成DNA,然后永久性整合到宿主基因组,实现用户选择的启动子驱动下的Cas9蛋白表达。

通过改造优化,我们的慢病毒载体删除了与病毒包装和转导相关的基因(这些基因由辅助质粒进行表达,用于病毒包装过程),使其产生的慢病毒颗粒是复制缺陷型的(即病毒只能用以转导细胞但是不能自我复制),具有很高的生物安全性。

我们提供多种版本的来源于Streptococcus pyogenes的SpCas9。这其中包括hCas9,人源化的野生型SpCas9,能有效地在靶序列制造DNA双链断裂(DSB);hCas9-DA10,核酸酶突变型的人源hCas9,只对靶序列的DNA单链造成切口;dCas9,bao'hanD10A和H840A突变,属于无核酸酶活性的SpCas9;SpCas9-HF1,亲和性强化的SpCas9;以及eSpCas9,特异性强化的SpCas9。dCas9融合转录激活结构域如dCas9/VP64和dCas9/VPR,或者融合转录抑制结构域后,如dCas9/KRAB,可分别应用于CRISPRa和CRISPRi系统。此外,我们提供的来源于Staphylococcus aureus的SaCas9,其序列要比SpCas9和来源于Acidaminococcus的AsCpf1更短(AsCpf1属于新一代CRISPR基因编辑系统。AsCpf1造成DSB时,两条DNA链上的切口位置相互错开,形成粘性末端)。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 zhu'ti
Science. 339:819 (2013) Description of genome editing using the CRISPR/Cas9 system
Nat. Biotech. 31:827 (2013) Specificity of RNA-guided Cas9 nucleases
Nat. Commun. 9:1911 (2018) Review on various Cas9 variants
Science. 343:84 (2014) Lentivirus-based CRISPR/Cas9 targeting
亮点

我们的Cas9表达慢病毒载体由第三代慢病毒载体系统衍生而来。经优化,该载体系统在大肠杆菌体内具有很高的拷贝数,包装的活病毒具有很高的滴度,对大多数宿主细胞具有高效的转导能力,能有效地把载体整合到靶细胞基因组并实现外源基因的高水平表达。Cas9表达慢病毒载体可实现用户自定义启动子驱动下的高水平Cas9表达。我们可提供多种类型的Cas9蛋白以满足不同的实验需求。

优势

灵活性:单Cas9表达载体可以与多个不同的gRNA共转染靶细胞打靶多个位点。此外,单Cas9表达载体可以通过慢病毒转导构建稳转细胞株。经FACS或抗生素筛选后,Cas9高水平表达的稳转细胞株可被用来接受gRNA转染从而获得高效的打靶率。

滴度高:我们的病毒载体可以包装出高滴度的病毒。我们提供的病毒包装服务,病毒滴度可以达到>109 TU/ml。在这样的病毒滴度下,如果选择合适的剂量去转导体外培养的哺乳动物细胞,则转导效率可接近100%。

宿主范围广泛:我们的病毒包装系统包装出来的病毒含有VSV-G包膜蛋白,此蛋白拥有非常广泛的亲和性,可以转导几乎所有的哺乳动物细胞,包括分裂细胞,非分裂细胞,原代细胞,稳定细胞系,干细胞,分化细胞,贴壁细胞和悬浮细胞等各类哺乳动物细胞,甚至还可以转导一些非哺乳动物细胞。使用传统的转染方式转导神经元细胞是非常难的,但是采用我们慢病毒载体系统可以轻易的实现神经元细胞的转导。相对于在某些细胞中具有较低转导效率的腺病毒和不能用于非分裂细胞的逆转录病毒而言,利用我们的慢病毒包装系统包装出来的病毒具有广泛的亲和性。

基因拷贝数相对均一:通常情况下,采用病毒转导的方式可以比较均一的将外源基因转入靶细胞中,而传统的质粒转染则呈现出较高的不均一性,导致某些细胞会获得较多拷贝质粒而某些则会获得较少甚至完全没有。

体内外实验均有效:我们的载体不仅拥有良好的体外细胞转导能力,同样适用于体内活体动物实验。

安全性:我们的病毒载体系统具备了以下两大特点,因而具有非常高的安全性。一、病毒包装和转导所必需的基因由三个辅助质粒分开表达。二、5' LTR的启动子自失活。因此,在进行病毒包装和病毒转导的时候不会产生具有复制能力的病毒颗粒,使用我们的载体对人体的健康威胁也是最低的。

不足之处

技术复杂:使用慢病毒载体时,需要在包装细胞中产生活病毒,然后测定病毒滴度。因此慢病毒转染相对于常规质粒转染,技术难度更高,周期更长。

PAM序列依赖: CRISPR/Cas9靶向特定位点时对gRNA识别序列3'端的PAM序列有严格要求。不同类型的Cas9蛋白需要使用不同的PAM序列。

载体关键元件

RSV promoter: Rous sarcoma virus promoter. It drives transcription of viral RNA in packaging cells. This RNA is then packaged into live virus.

5' LTR-ΔU3: A deleted version of the HIV-1 5' long terminal repeat. In wildtype lentivirus, 5' LTR and 3' LTR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome and point in the same direction. Upon viral integration, the 3' LTR sequence is copied onto the 5' LTR. The LTRs carry both promoter and polyadenylation function, such that in wildtype virus, the 5' LTR acts as a promoter to drive the transcription of the viral genome, while the 3' LTR acts as a polyadenylation signal to terminate the upstream transcript. On our vector, Δ5' LTR is deleted for a region that is required for the LTR's promoter activity normally facilitated by the viral transcription factor Tat. This does not affect the production of viral RNA during packaging because the promoter function is supplemented by the RSV promoter engineered upstream of Δ5' LTR.

Ψ: HIV-1 packaging signal required for the packaging of viral RNA into virus.

RRE: HIV-1 Rev response element. It allows the nuclear export of viral RNA by the viral Rev protein during viral packaging.

cPPT: HIV-1 Central polypurine tract. It creates a "DNA flap" that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection. This improves vector integration into the host genome, resulting in higher transduction efficiency.

Promoter: The promoter that drives the expression of the downstream Cas9 gene is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of the Cas9 nuclease variant chosen by the user.

WPRE: Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element. It enhances viral RNA stability in packaging cells, leading to higher titer of packaged virus.

mPGK promoter: Mouse phosphoglycerate kinase 1 gene promoter. It drives the ubiquitous expression the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

3' LTR-ΔU3: A truncated version of the HIV-1 3' long terminal repeat that deletes the U3 region. This leads to the self-inactivation of the promoter activity of the 5' LTR upon viral vector integration into the host genome (since 3' LTR is copied onto 5' LTR during viral integration). The polyadenylation signal contained in ΔU3/3' LTR serves to terminates all upstream transcripts produced both during viral packaging and after viral integration into the host genome.

SV40 early pA: Simian virus 40 early polyadenylation signal. It further facilitates transcriptional termination after the 3' LTR during viral RNA transcription during packaging. This elevates the level of functional viral RNA in packaging cells, thus improving viral titer.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.