哺乳动物增强子检测质粒载体(体内检测系列)

概述

该载体系统设计用于在小鼠模型中,高效分析哺乳动物增强子。通常情况下,将感兴趣的增强子克隆到该载体中,并将构建好的载体用于制备转基因小鼠。对转基因胚胎或成年小鼠中LacZ报告基因的表达情况进行检测,可以进一步分析增强子的活性。

该载体系统可用于筛选增强子元件,分析增强子的组织特异性,比较不同增强子的活性,谱系追踪以及其他应用。

关于该载体系统的更多信息,请参考一下文献。

参考文献 主题
Nature. 444:499-502 (2006) Use of the vector systemtocarry out genome-wide testing of putative enhancers in the mouse
Development. 105:707-714 (1989) Cloning of the Hsp68 minimal promoter

亮点

我们的载体系统是基于常规质粒基因表达载体而构建的。待测增强子位于Hsp68最小启动子(Hsp68_mini)的上游,可控制下游LacZ报道基因的表达。有活性的增强子会促进最小启动子增强LacZ基因的表达;在缺乏活性增强子的情况下,Hsp68_mini具有非常弱的本底表达能力,会使LacZ基因弱表达或不表达。在胚胎或组织切片中,通过X-gal与LacZ的显色作用可以高度灵敏地原位检测增强子活性。

优势

易于制备转基因动物:通过常规原核注射,可以很容易地高效制备转基因胚胎或活体小鼠。

简单而灵敏:使用LacZ作为报告基因,X-gal染色会产生明显的蓝色,即使在低表达水平下也可以轻松检测到,因此可以非常灵敏地判断增强子活性。

不足之处

随机整合:当通过原核注射将载体用于制备转基因小鼠时,载体会以一个或多个拷贝的方式随机整合到宿主基因组中。整合位点相邻的基因组序列以及拷贝数和整合片段的不确定性,会影响报告基因的表达水平和特异性。为了克服这一点,对于给定的载体通常需要制备多个转基因品系,以便鉴定多个品系的LacZ表达情况,进而确定增强子的真实活性。

载体关键元件

Enhancer: Your enhancer of interest is placed here.

Hsp68 minimal promoter: The minimal promoter sequence from mouse Hsp68 (heat shock protein 68kDa). This will drive transcription of the reporter if an enhancer element is present to activate it. In the absence of such enhancer activity, the minimal promoter will be almost completely inactive.

LacZ: The beta-galactosidase reporter gene. The encoded enzyme converts the colorless and soluble X-gal to an intensely blue insoluble product that stains the cells in which LacZ is expressed.

SV40 early pA: Simian virus 40 early polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.