哺乳动物shRNA表达腺病毒载体

概述

腺病毒shRNA干扰载体系统是一种可在多种哺乳动物细胞中稳定干扰靶基因表达的高效方法。该载体不会整合到宿主细胞的基因组中,而是以游离DNA形式存在。该系统是体内应用测试的优先使用方法。

腺病毒载体来源于诱发普通感冒的腺病毒,野生型腺病毒基因组是线性双链DNA。

腺病毒重组载体构建完成后转染进入包装细胞。在包装过程中,位于两个反向重复序列(ITRs)之间的DNA片段与由包装细胞表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。

当病毒转导宿主细胞时,两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞,并以游离DNA的形式存在于细胞核中。由人类U6启动子驱动表达的shRNA将会导致靶基因mRNA的降解。

通过改造优化,我们的腺病毒载体缺失了E1A、E1B和E3区,前两者与病毒包装相关(这两个基因已被整合到包装细胞的基因组中)。因此,运用我们的病毒载体包装出来的病毒是复制缺陷型的(只能转导靶细胞而不能自我复制),大大提高了生物安全性。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Proc Natl Acad Sci U S A. 91:8802 (1994) The 2nd generation adenovirus vectors
J Gen Virol. 36:59 (1977) A packaging cell line for adenovirus vectors
J Virol. 79:5437 (2005) Replication-competent adenovirus (RCA) formation in 293 Cells
Gene Ther. 3:75 (1996) A cell line for testing RCA

亮点

我们的载体来源于血清5型腺病毒(Ad5)。经优化,该载体在大肠杆菌体内具有很高的拷贝数,包装出来的病毒具有高滴度,能有效转导靶细胞,实现外源基因的高水平表达。人类U6启动子能够驱动shRNA的高水平转录,同时,我们经过优化的shRNA茎-环序列可高效形成有效的干扰RNA。

优势

对宿主基因组造成破坏的低风险性:在转导进入靶细胞后,腺病毒载体在细胞核保持着游离DNA的状态,可以降低宿主基因组被破坏而致癌的风险,使其成为人类体内实验的理想载体。

超高病毒滴度:腺病毒可通过再次转导包装细胞而得到大量扩增,从而获得超高滴度病毒,慢病毒载体、逆转录病毒载体和AAV载体都不具有这个特性。我们提供的腺病毒滴度可以达到>1010 PFU/ml。

宿主范围广泛:来源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳动物细胞都能被腺病毒载体转导,但某些细胞类型则比较难转导(见下文不足之处)。

体内外实验均有效:我们的载体不仅能用于体内活体动物实验,还具有体外细胞转导能力。

安全性:为了确保腺病毒载体的生物安全性,我们的腺病毒载体缺失了病毒包装所必须的基因(这些基因被整合到包装细胞的基因组)。 所以,利用我们的腺病毒载体包装出来的病毒是复制缺陷型的,并且只有在包装细胞中才具有复制能力。

不足之处

载体DNA非整合型:腺病毒基因组不会整合到靶细胞的基因组中,而是以游离DNA的形式存在,并且随着时间推移逐渐丢失,特别是在分裂细胞中。

难以转导特定类型的细胞:虽然我们的腺病毒载体可以转导很多类型的细胞包括非分裂细胞,但对某些特定类型的细胞如内皮细胞、平滑肌细胞、呼吸上皮分化细胞、外周血细胞、神经元和造血干细胞等,却无法进行有效的转导。

较强的免疫原性:活腺病毒会在动物体内引起强烈的免疫反应,从而限制了其在体内的某些应用。

技术复杂:使用腺病毒载体时,需要在包装细胞中产生活病毒,然后测定病毒滴度。这些过程技术难度更高,周期更长。

载体关键元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

Ψ: Adenovirus packaging signal required for the packaging of viral DNA into virus.

U6 Promoter: Drives expression of the shRNA. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.

Sense, Antisense: These sequences are derived from your target sequences, and are transcribed to form the stem portion of the “hairpin” structure of the shRNA.

Loop: This optimized sequence is transcribed to form the loop portion of the shRNA “hairpin” structure.

Terminator: Terminates transcription of the shRNA.

hPGK promoter: Human phosphoglycerate kinase 1 gene promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

ΔAd5: Portion of Ad5 genome between the two ITRs minus the E1A, E1B and E3 regions.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. See description for 5’ ITR.

pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in medium copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

PacI: PacI restriction site (PacI is a rare cutter that cuts at TTAATTAA). The two PacI restriction sites on the vector can be used to linearize the vector and remove the vector backbone from the viral sequence, which is necessary for efficient packaging.