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载体指南

AAV基因诱导表达载体(Tet-On)

概述

AAV诱导型基因表达载体结合了载体家应用广泛的AAV载体系统和Tet-On基因诱导表达系统,帮助您在体内体外都能进行四环素诱导表达实验。

Tet-On基因诱导表达载体系统是在哺乳动物细胞中进行实时GOI表达的强大工具。我们的Tet-On基因诱导表达载体系统在无四环素及其类似物(多西环素)的情况下可以做到GOI几近完全沉默并且在加入四环素及其类似物(多西环素)的情况下快速响应实现GOI表达。这是通过tTS和rtTA蛋白响应四环素及其类似物(多西环素)的基因调控功能实现的。当不存在四环素及其类似物(如doxycycline)的情况下,目的基因几乎或完全沉默;当往体系中添加四环素或其他类似物(如doxycycline)时,目的基因得到快速高水平表达。四环素不存在的情况下时,衍生于TeR(Tet抑制蛋白)和KRAB-AB(Kid-1蛋白转录抑制结构域)的融合蛋白tTS结合TRE启动子,导致基因转录抑制。另一方面,四环素存在时,衍生于突变型Ter抑制蛋白和VP16蛋白(转录激活结构域)的融合蛋白rtTA结合TRE启动子,激活基因转录。

AAV诱导表达载体首先以质粒的方式构建并使用E. coli扩增,然后转染进入包装细胞。在包装过程中,位于两个反向重复序列(ITR)之间的DNA片段与由包装细胞表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。位于两个ITR之间的四环素诱导基因表达盒包含两部分:一个四环素响应因子(TRE)启动子驱动的用户自定义GOI,以及一个一个广泛启动子或者组织特异性启动子驱动的tTS/rtTA调控蛋白。当病毒转导宿主细胞时,两个ITR区域之间的序列和其他病毒基因组分由此进入了靶细胞。GOI的表达可通过加入四环素启动。

关于AAV载体的更多信息,请查看我们的AAV载体介绍页面

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Methods in Enzy. 507:229-54 (2012) Review of AAV virology and uses
Curr Opin Pharmacol. 24:59-67 (2015) AAV use in gene therapy, and serotype differences
Science. 268:1766-9 (1995) Development of rtTA.
J Gene Med. 1:4-12 (1999) Development of tTS.
亮点

我们的Tet-On基因诱导表达载体系统在无四环素的情况下可以做到GOI几近完全不表达,但是在加入四环素时快速表达。我们的AAV载体是经过优化的,可在大肠杆菌中进行高拷贝复制,是一个包装病毒滴度高,细胞转导效率高,转基因高水平表达的载体系统。该载体可用所有已知衣壳蛋白血清型的辅助质粒进行包装,包装出来的病毒具有非常高的转导效率,且具有极高的生物安全性。

优势

类似开关的严格基因表达调控:只依赖rtTA的Tet-on系统在没有诱导剂的情况下,会有明显的泄露表达。我们的Tet-On基因表达载体可严格调控基因的表达,在没有诱导剂的情况下可将背景泄露表达最小化,并保持该系统对四环素诱导的高灵敏度。

高水平表达:TRE启动子可驱动GOI在诱导状态下高水平表达。

安全性:AAV是可供选择的最安全的病毒载体,它是复制缺陷的,不会引起任何人类疾病。

对宿主基因组造成破坏的低风险性:在转导进入靶细胞后,AAV病毒载体在细胞核保持着游离DNA的状态,可以降低宿主基因组被破坏而致癌的风险,使其成为人类体内实验的理想载体。

高病毒滴度:利用我们的AAV病毒载体可以包装成高滴度的病毒。我们提供的病毒包装服务病毒滴度可达到>1013 GC/ml。

宿主范围广:针对不同来源的常用哺乳动物(如人、小鼠和大鼠)细胞和组织,将我们的AAV载体包装成对其具有亲和性的血清型,可轻易实现高效转导。但是,某些类型的细胞仍然难以转导(见下文不足之处),这与所用的血清型有关。

体内外实验均有效:我们的载体不仅能用于体内活体动物实验,还具有体外细胞转导能力。

不足之处

载体容量小:AAV是我们所有病毒载体系统中装载量最小的。AAV的两个ITR之间所能容纳的最大序列长度是4.7kb。在Tet-On系统中,用于病毒包装、转导和四环素诱导的基因序列另外占用2.1kb,因此留作自定义的GOI长度需要小于2.6kb。

难以转导特定类型的细胞:当利用合适的血清型进行包装时,我们的AAV载体系统可以转导很多不同类型的细胞,包括非分裂细胞。不同AAV血清型对不同类型的细胞具有不同的亲嗜性,针对某种特定类型的细胞需要特定血清型。

技术复杂:使用AAV病毒载体时,需要在包装细胞中产生活病毒,然后测定病毒滴度。这些过程相对于常规质粒转染,技术难度更高,周期更长。在订购载体的同时,可以通过订购我们的病毒包装服务轻松解决这些问题。

载体关键元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

TRE promoter: Tetracycline-responsive element promoter (2nd generation). This element can be regulated by a class of transcription factors (e.g. tTA, rtTA and tTS) whose activities are dependent on tetracycline or its analogs (e.g. doxycycline).

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

CBh promoter: CMV early enhancer fused to modified chicken β-actin promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream tTS/rtTA cassette.

tTS: Tetracycline-controlled transcriptional silencer. This protein binds to TRE promoter to actively suppress gene transcription only in the absence of tetracycline and its analogs (e.g. doxycycline).

T2A: Self-cleaving 2A peptide from thosea asigna virus that allows multiple proteins to be made from a polycistronic transcript containing multiple ORFs separated by T2A. The cleavage occurs through a putative “ribosomal skipping” mechanism.

rtTA: Reverse tetracycline responsive transcriptional activator M2 (2nd generation). This protein binds to TRE promoter to activate gene transcription only in the presence of tetracycline or its analogs (e.g. doxycycline). It has higher sensitivity to the inducing drug and lower leaky activity in the absence of the drug compared to its predecessor.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation. It facilitates transcriptional termination of the upstream tTS/rtTA cassette.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.