哺乳动物基因普通表达腺相关病毒载体

概述

腺相关病毒(AAV)载体系统是一种备受欢迎的体内外基因传递系统,对哺乳动物多种类型细胞具有高效的转导效率。不同于腺病毒,AAV的免疫原性极低,在体内几乎没有致病性,使得AAV成为许多动物研究的理想工具。

AAV重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中,位于两个反向重复序列(ITRs)之间的DNA片段与辅助质粒表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。

当病毒转导宿主细胞时,两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞,线性双链DNA基因组以游离DNA的形式存在于细胞核中。

在大多数情况下,可以在生物安全1级(BSL1)设施中处理AAV。AAV是复制缺陷型的、不会引起炎症反应和引发人类疾病。

人们已从自然界中鉴定出许多AAV病毒株,根据病毒表面衣壳蛋白的不同抗原将它们分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的组织亲和性(即感染组织特异性)。当我们的AAV载体使用不同的衣壳蛋白包装病毒时,则会赋予病毒不同的血清型。下表列出了不同的AAV血清型及对应的组织亲和性。

血清型

组织亲和性

AAV1 SM, CNS, lung, retina, pancreas, heart, liver
AAV2 SM, CNS, liver, kidney, retina
AAV3 SM
AAV4 CNS, retina, lung, kidney
AAV5 SM, CNS, lung, retina
AAV6 SM, heart, lung, adipose, liver
AAV7 SM, retina, CNS, liver
AAV8 SM, CNS, retina, liver, pancreas, heart, kidney, adipose
AAV9 SM, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, testes, kidney
AAVrh10 SM, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, kidney

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Methods in Enzy. 507:229-54 (2012) Review of AAV virology and uses
Curr Opin Pharmacol. 24:59-67 (2015) AAV use in gene therapy, and serotype differences

亮点

我们的AAV载体是经过优化的,可在大肠杆菌中进行高拷贝复制,是一个包装病毒滴度高,细胞转导效率高,转基因高水平表达的载体系统。该载体可用所有已知衣壳蛋白血清型的辅助质粒进行包装,包装出来的病毒具有非常高的转导效率,且具有极高的生物安全性。

优势

安全性:AAV是可供选择的最安全的病毒载体,它是复制缺陷的,不会引起任何人类疾病。

对宿主基因组造成破坏的低风险性:在转导进入靶细胞后,AAV病毒载体在细胞核保持着游离DNA的状态,可以降低宿主基因组被破坏而致癌的风险,使其成为人类体内实验的理想载体。

高病毒滴度:利用我们的AAV病毒载体可以包装成高滴度的病毒。我们提供的病毒包装服务病毒滴度可达到>1011 GC/ml。

宿主范围广:针对不同来源的常用哺乳动物(如人、小鼠和大鼠)细胞和组织,将我们的AAV载体包装成对其具有亲和性的血清型,可轻易实现高效转导。但是,某些类型的细胞仍然难以转导(见下文不足之处),这与所用的血清型有关。

体内外实验均有效:我们的载体不仅能用于体内活体动物实验,还具有体外细胞转导能力。

不足之处

载体容量小:AAV是我们所有病毒载体系统中装载量最小的。AAV的两个ITR之间所能容纳的最大序列长度是4.7 kb,允许使用者插入~4.2 kb的目的序列。

难以转导特定类型的细胞:当利用合适的血清型进行包装时,我们的AAV载体系统可以转导很多不同类型的细胞,包括非分裂细胞。不同AAV血清型对不同类型的细胞具有不同的亲嗜性,针对某种特定类型的细胞需要特定血清型。

技术复杂:使用AAV病毒载体时,需要在包装细胞中产生活病毒,然后测定病毒滴度。这些过程相对于常规质粒转染,技术难度更高,周期更长。在订购载体的同时,可以通过订购我们的病毒包装服务轻松解决这些问题。

载体关键元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

Promoter: The promoter that drives your gene of interest is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. See description for 5’ ITR.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.