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常见问题

为什么我的药物筛选标记不能让细胞产生抗性?

药物筛选基因通常只需要低至中等程度的表达即可有效,但也有例外。以下是细胞无抗药性的最常见原因:

使用的抗生素剂量过高

药物反应因细胞不同而异。在使用抗生素之前,建议您对细胞制作一个致死曲线(也称“剂量反应曲线”),摸索出能有效杀死未转染或转导细胞的最低药物浓度。即使细胞有抗药性基因,但过高的药物剂量也会导致细胞死亡,且还可能危害细胞的生长状态。某些细胞对某些药物极其敏感,这时您可能需要考虑更换另一种药物筛选标记。

了解常用抗生素工作浓度和药筛时间

弱启动子驱动药物筛选基因的表达

有一些启动子本身就比较弱(如UBC),只能驱动药物筛选基因的弱表达,您可以考虑使用一个强的广泛性启动子(如EF1A)。

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在慢病毒和MMLV载体中表达药物筛选基因

对于逆转录病毒载体系统(慢病毒或者MMLV),聚腺苷酸化信号(poly A)不能存在于LTR之间,因为这会抑制病毒的包装。多聚腺苷酸化信号存在于3'LTR中,来自上游启动子的转录会经过上游ORF的末尾继续往下游的启动子和ORF转录,这会导致下游ORF的表达部分受到抑制。当下游ORF为药物筛选基因时,其表达会大大减少。您可以采取如下措施提高荧光蛋白的表达:

  • 使用不同的载体系统,比如使用常规载体,腺病毒载体或腺相关病毒载体

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  • 如果考虑在多顺反子的上游表达盒表达药物筛选基因,您可以使用2A linker连接目的基因和药物筛选基因。然而,这可能会影响多顺反子中其他ORF的生物学功能,也可能导致药物筛选基因表达较弱,且会增加载体构建的成本和时间。

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药物筛选基因在IRES的下游

在包含一个或多个IRES元件的多顺反子中,与上游ORF相比,下游ORF表达水平比较低(通常为上游的10%-20%)。如果药物筛选基因在IRES的下游表达,则表达量会较低。如果您必须在多顺反子的下游表达药物筛选基因,您可以考虑使用2A肽(如P2A或T2A),而不是IRES。通过使用2A肽,多顺反子下游ORF通常与上游ORF的表达量相当(或稍微低一点)。然而,2A肽也有缺陷,如可能会影响靶基因(GOI)的功能。当存在多个2A肽时,下游ORF倾向于以较低水平表达。另外,2A肽的自我切割并不是100%有效的,其效率会受上下游ORF序列的影响。需要特别注意的是2A肽的切割会在上游蛋白的C末端留下额外的短肽,并在下游蛋白的N末端留下额外的脯氨酸。在大多数实验应用中,这种情况不会产生不良影响,但是在某些情况下可能会影响蛋白功能。

了解更多IRES和2A肽的对比信息